蛋白质质谱鉴定的那些事

蛋白质质谱鉴定的那些事

蛋白质根据样品的纯度，鉴定精度的要求不同，可以分为对一级质谱，二级质谱（即串联质谱）。很多刚接触蛋白质鉴定的新手很可能对一级、二级质谱鉴定方法还不太了解。在这期文章中，小编就通过蛋白质鉴定的流程来系统地帮大家梳理一下蛋白质鉴定的基础知识，帮助大家选用适合的蛋白质鉴定方法。

蛋白质质谱鉴定

一、蛋白分离纯化

在对细胞中的蛋白质分析鉴定前，首先需要对细胞进行破碎，将总蛋白质分离提纯，接着再将目标蛋白分离出来，进行进一步分析。然而在蛋白质分离纯化的过程中也有一下可能影响后续蛋白质鉴定效率的因素需要考虑： 1. 蛋白质浓缩 蛋白质样品可以用沉淀，膜分离，分离柱，冷冻干燥等各种方式进行浓缩， 具体蛋白浓缩方法应根据样品的特点进行选择，可用SDS样品液从色谱样上中洗脱蛋白，从而保持样本体积较小。

二、蛋白质酶切消化

蛋白质在质谱鉴定前通常需要经过蛋白质酶切消化步骤，将大分子蛋白质酶切成多肽片段，以便于提升质谱鉴定的精度。蛋白质酶切通常选用胰蛋白酶进行蛋白质酶切处理，有时也会根据预测的蛋白质序列选测多种其他蛋白酶进行酶切。蛋白质经过蛋白酶的酶切消化后成肽段混合物，再经过高效液相色谱对多肽片段进行初步分离，以进一步提升质谱鉴定的准确度。

三、蛋白质一级质谱鉴定

蛋白质一级质谱鉴定主要便是通过测定蛋白质酶切产生的肽段质量图谱，即肽质指纹谱（peptide mass fingerprint，PMF），再将测定的肽质量与数据库中理论肽质量相配比（理论肽是由实验所用的酶来"断裂"蛋白所产生的）。配比的结果是按照数据库中肽片段与未知蛋白共有的肽片段数作一排行榜，"冠军"肽片段可能代表一个未知蛋白。若冠亚军之间的肽片段存在较大差异，且这个蛋白可与实验所示的肽片段覆盖良好，则说明正确鉴定的可能性较大。

蛋白质质谱鉴定流程

四、蛋白质串联质谱鉴定

在第一阶段进行肽质指纹鉴定之后，一个有意义且丰度高的肽片段在质谱仪被选作"母离子"，母离子飞行至耳机质谱反应器中碰撞碎裂为"子离子"。在反应器中，用逐渐降低的电压可测量至检测器的不同大小的片段。 连续的片段间差异即是肽片段的氨基酸质量。由氨基酸的质量可以推测出氨基酸的类别以及氨基酸上面可能发生的翻译后修饰。连续测得的氨基酸序列组成肽序列标签。然后，使用多个肽序列标签与数据库中蛋白质的序列进行比对，鉴定出目的蛋白质。