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10种癌症、85万细胞：学习单细胞+Bulk+空间多组学经典之作的生信分析思路（附代码）

news 2026/3/27 0:50:20

为什么有些癌症患者对免疫治疗反应良好，而另一些患者却几乎无效？除了癌细胞本身，肿瘤周围那些被称为“土壤”的间质细胞是否在暗中操纵着一切？

2022年11月4日，Nature Communications杂志发表了四川大学罗晗团队、徐恒团队与韩国光州科学技术院 Jihwan Park 团队的研究成果，该研究通过对10种实体瘤的单细胞制图，发现了癌相关成纤维细胞（CAF）的激活状态是决定免疫治疗预后的关键。今天我们就来拆解一下这篇生信文章：Pan-cancer single-cell analysis reveals the heterogeneity and plasticity of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment。

研究概述

癌相关成纤维细胞（CAF）是肿瘤微环境（TME）中占比最高的间质成分，但其在不同癌症中的通用特征尚不明确。本研究通过泛癌单细胞分析，识别了CAF在激活过程中的三种不同状态，并证实其中一种特定状态（CAFstate3）与免疫治疗的不良预后直接相关。此外，研究还揭示了CAF除了起源于正常成纤维细胞外，还可能由内皮细胞、巨噬细胞和外周神经细胞转化而来，展现了极强的表型塑造能力。

实验设计

研究整合了12项独立研究的公共数据及内部数据，涵盖肺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌等10种常见实体瘤，共计226份样本（含148份原发瘤、53份癌旁及25份正常组织）。所有单细胞数据均基于10x Genomics平台产生。研究通过单细胞转录组测序（scRNA-seq）进行初步发现，结合批量转录组（Bulk RNA-seq）进行临床预后验证，最后利用空间转录组（ST）和多重免疫荧光（mIF）技术在组织原位观察细胞间的相互作用。

研究结果

图1：通过scRNA-seq绘制泛癌TME景观，鉴定出34个TME相关集群，构建了包含855,271个细胞的泛癌单细胞图谱，明确成纤维细胞、淋巴细胞、髓系细胞、内皮细胞和浆细胞这五大细胞组分及部分集群的癌型富集和临床关联。

图2：定义了CAF激活的三个阶段，其中state3处于高度去分化状态，且高表达免疫调节相关基因。

图3：CAFs通过配体-受体相互作用调控免疫细胞功能和血管生成，CAFstate3与免疫治疗不良预后相关，其在多个临床队列中预示免疫治疗的总生存期缩短。

图4：研究鉴定出抗原提呈型CAF（CAFap），其在发育轨迹上位于巨噬细胞向肌纤维母细胞转化的中间位置。

图5：鉴定了内皮细胞向CAF转化的过程（EndMT），该群细胞在乳腺癌、胃癌和结直肠癌中与较差的疾病特异性生存期相关。

图6：研究揭示了SPP1+巨噬细胞通过SPP1-CD44轴与发生间质转化的内皮细胞近距离接触，共同驱动肿瘤血管生成。

图7：最后总结了CAF的多种起源及其通过免疫调节和促进血管生成影响肿瘤进展及治疗反应的机制模型。

数据分析

生信分析

本研究涉及单细胞转录组（scRNA-seq）、批量转录组（Bulk RNA-seq）和空间转录组（Spatial Transcriptomics）的联合分析。

分析流程

1. 单细胞转录组分析：

• 使用 Cell Ranger 进行比对和定量，Scrublet 去除双细胞。
• 利用 Seurat 进行质量控制（过滤基因数<200或>6000，线粒体占比>20%的细胞）和 LogNormalize 归一化。
• 通过 RunFastMNN 算法矫正不同研究间的批次效应，并进行 Louvain 聚类及 UMAP 可视化。
• 使用 Monocle 2 建立拟时序轨迹，通过拟时序相关基因定义 CAF 的三种激活状态。
• 采用 SCENIC 识别驱动不同 CAF 亚群的核心转录因子。
• 利用 CellPhoneDB 和 NicheNet 预测细胞配体-受体交互及下游靶基因。

2. 批量转录组分析：

• 使用 CIBERSORT 算法将单细胞定义的 CAF 状态反褶积到大量患者样本中，评估不同状态的占比。
• 利用 ssGSEA 计算特定细胞亚群的特征评分。

3. 空间转录组分析：

• 使用 Space Ranger 处理原始数据，在组织切片上定位 CAFEndMT 和 SPP1+ 巨噬细胞。
• 通过相关性分析验证两类细胞在空间位置上的共定位。

4. 组学联合分析

• scRNA-seq与批量转录组学联合：将单细胞水平鉴定的CAFs特征应用于批量数据，验证其泛癌预后价值。
• scRNA-seq与空间转录组学联合：验证CAFEndMT与SPP1+TAMs的空间共定位关系。
• scRNA-seq与多重免疫荧光（mIF）联合：通过mIF验证单细胞水平发现的细胞亚型及相互作用的空间分布。

统计分析

连续变量的比较采用 Wilcoxon 秩和检验或 Mann-Whitney 检验。生存分析使用 Kaplan-Meier 方法及 Log-rank 检验评估显著性。针对免疫治疗预后，采用多变量 Cox 回归分析校正协变量，以确定 CAFstate3 的独立预后价值。空间距离分布的显著性通过双侧 Wilcoxon 检验确定。

总结

研究意义

该研究通过大规模泛癌分析，突破了以往单一种类癌症研究的局限，提出了 CAF 激活状态的概念。研究不仅为理解肿瘤微环境的复杂性提供了新视角，更重要的是发现 CAFstate3 可以作为免疫检查点抑制剂疗效的预测指标。这暗示通过干预 CAF 的激活状态或阻断其产生的抑制性信号，有望提升现有免疫治疗的临床成功率。

文章复现

这篇文章的原始数据和生信分析代码都公开了，非常全面。

原始测序数据及处理后的矩阵：

• 单细胞综合数据集：GEO (GSE210347)
• 空间转录组原始数据：Genome Sequence Archive (HRA003299, HRA003300)
• 其他重分析的公共数据集编号包括：GSE134355, GSE141445, E-MTAB-8107, GSE157703, GSE131907, GSE138709, E-MTAB-6149, E-MTAB-6653, CRA001160, GSE154778, HRA000212, HRA000686。

分析代码：

• Github 代码仓库：https://github.com/Xiaxy-XuLab/PanCAF
• 交互式浏览器：https://gist-fgl.github.io/sc-caf-atlas/