详解蛋白质质谱鉴定技术原理和方法
详解蛋白质质谱鉴定技术原理和方法
质谱分析技术有着高灵敏度，高精准度等特点，能够准确快速地鉴定蛋白质。传统的质谱技术仅限于小分析物质的分析，随着新的离子化技术的出现和发展，如基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和电喷雾电离质谱（ESI-MS）等，为准确快速鉴定蛋白质等大分子提供了便捷的条件。目前，酶切蛋白质，液相色谱分离肽段，串联质谱分析多肽氨基酸序列，联合质谱数据分析已成为了鉴定蛋白质的首选方案。本文主要讲下蛋白质谱鉴定的原理和应用。
一、MALDI-TOF
基质辅助激光解吸附质谱技术（Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight, MALDI-TOF）的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。MALDI所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系。MALDI产生的离子常用飞行时间（TOF）检测器来检测， 理论上讲，只要飞行管的长度足够，TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的， 因此MALDI-TOF质谱很适合对蛋白质、多肽等生物大分子的研究。
1、技术特点
• MALDI-TOF 鉴定方便、快速，可以同时做上百个斑点 • 主要用于纯蛋白或简单样本的鉴定，如2DE斑点 • 成本较低
• 蛋白质溶液：纯度> 90%；蛋白质总量> 5 ug，浓度> 0.1 ug/ul • 双向凝胶电泳点：考染、银染点清晰可见 • SDS-PAGE胶条：单一蛋白质，考染、银染条带清晰可见
二、ESI-MS
电喷雾电离质谱（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。
1、技术特点
• 高通量：一次可鉴定数十至数百种蛋白质 • 灵敏度高：可检测样品浓度极低的胶点• 通用性强：可分析蛋白质条带、免疫共沉淀洗脱液、组织提取液、全细胞裂解液、亚细胞分离组分等多种形式的样品
2、样品要求
• 蛋白质溶液：蛋白质总量>5 ug，浓度>0.1 ug/ul。缓冲液中不含去污剂NP40、Triton X-100等。 • SDS-PAGE胶条：考染、银染条带清晰可见。
三、制备质谱检测样品注意事项：
• 样本制备过程应避免各类污染和反复冻融 • 配胶和切胶避免角蛋白污染，配胶试剂专用，切胶刀具使用干净一次性的 • 蛋白考染，一般肉眼可见的量都是可以被质谱鉴定到的 • 银染的蛋白质不能使用戊二醛作为固定剂，因为戊二醛使蛋白质发生不可逆交联，会影响质谱鉴定结果
四、质谱技术的应用
1. 蛋白质纯度分析以及分子量测定 MALDI-TOF是一种软电离技术，可用于检测目标蛋白或多肽是否存在,有无二聚体存在,以及进行纯度情况的大体评估。MALDI-TOF鉴定分子量范围也非常广，能够鉴定700-60000Da的蛋白分子量，准确度高达0.1%~0.01%，远远高于目前常规应用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术。