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生信复现宝藏：从单细胞图谱到空间共定位，手把手教你分析NC级别的课题（附全套代码）

news 2026/3/27 4:41:19

结直肠癌作为高发恶性肿瘤，免疫治疗仅对极少数错配修复缺陷的患者有效，绝大多数患者仍面临治疗手段有限的困境。肿瘤微环境的复杂调控，究竟是如何让免疫细胞“寸步难行”，又藏着哪些未被发掘的治疗靶点？

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2022年4月，《Nature Communications》杂志发表了上海交通大学医学院团队的研究成果，该研究通过单细胞和空间转录组分析，揭示了结直肠癌中FAP+成纤维细胞与SPP1+巨噬细胞的相互作用及其对免疫治疗的影响。今天我们就来拆解一下这篇生信文章Single-cell and spatial analysis reveal interaction of FAP+ fibroblasts and SPP1+ macrophages in colorectal cancer。

研究概述

本研究对结直肠癌肿瘤及癌旁组织的54103个细胞进行单细胞转录组分析，明确肿瘤微环境的细胞组成特征，鉴定出肿瘤特异性的FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞。通过14个独立结直肠癌队列验证二者浸润呈正相关，结合免疫荧光染色和空间转录组证实其紧密定位。研究发现二者的相互作用由趋化素、TGF-β和白介素-1调控，可促进免疫排斥性促纤维增生结构形成，限制T细胞浸润，且高表达FAP或SPP1的患者抗PD-L1治疗获益较低，为结直肠癌免疫治疗提供了新的潜在策略。

实验设计

收集5例非转移性结直肠癌患者的肿瘤组织和癌旁正常黏膜组织，进行10× Genomics单细胞RNA测序；对4例结直肠癌患者肿瘤组织切片进行10× Genomics Visium空间转录组测序；结合流式细胞术、免疫荧光染色、ELISA实验验证细胞表型和分子表达；利用CIBERSORTx算法在14个独立结直肠癌队列中验证细胞浸润特征；通过生信分析解析细胞亚型、分化轨迹、细胞间相互作用及临床相关性；借助IMvigor210数据集分析FAP/SPP1表达与抗PD-L1治疗疗效的关系。

研究结果

图1：单细胞转录组图谱鉴定出结直肠癌及癌旁组织中的9种主要细胞类型，各细胞类型在肿瘤和癌旁组织中的浸润程度存在差异。

图2：结直肠癌肿瘤微环境中多种细胞的信号通路发生重塑，间充质基质细胞与髓系细胞浸润呈显著正相关，且二者高浸润与患者不良生存相关。

图3：间充质基质细胞可分为10个亚型，FAP+成纤维细胞为肿瘤特异性亚型，由FGFR2+成纤维细胞或ICAM1+梭形细胞分化而来，TWIST1为其关键转录因子，且高浸润与患者无进展生存期缩短相关。

图4：髓系细胞可分为多个亚型，SPP1+巨噬细胞为肿瘤特异性亚型，由THBS1+巨噬细胞分化而来，STAT1为其关键转录因子，高浸润同样与患者无进展生存期缩短相关。

图5：FAP+成纤维细胞与SPP1+巨噬细胞的浸润在结直肠癌队列中高度相关，二者均高浸润的患者生存预后最差，且蛋白水平在肿瘤组织中显著升高，免疫荧光证实二者在组织中紧密共定位。

图6：空间转录组证实FAP+成纤维细胞与SPP1+巨噬细胞在结直肠癌组织中共同定位，且围绕恶性上皮细胞分布，其所在区域富集细胞外基质相关通路，同时伴随淋巴细胞浸润排斥。

图7：FAP+成纤维细胞与SPP1+巨噬细胞通过多种配体-受体对发生相互作用，趋化素为关键调控分子，SPP1+巨噬细胞可通过分泌TGFB1、IL1A/IL1B促进FAP+成纤维细胞的细胞外基质重塑。

图8：FAP+成纤维细胞与SPP1+巨噬细胞均高浸润的结直肠癌为免疫排斥型微环境，虽具有高肿瘤新抗原特征但淋巴细胞浸润不足，且高表达FAP/SPP1的患者抗PD-L1治疗响应率低、生存预后差，同时提出二者相互作用调控结直肠癌微环境的工作模型。

数据分析

生信分析

本研究涉及的组学技术包括：单细胞RNA测序（scRNA-seq）、空间转录组测序（ST）、批量RNA测序（bulk RNA-seq）、基因芯片。

单细胞RNA测序

• 原始测序数据经bcl2fastq2转换为fastq文件，FastQC进行质量控制；
• Cell Ranger完成序列比对和定量；
• Seurat包进行数据标准化，筛选高可变基因并进行主成分分析；
• Harmony算法校正批次效应；
• 基于校正后的主成分进行图聚类和UMAP降维聚类，结合已知标记基因进行细胞注释；
• FindAllMarkers函数筛选差异表达基因；
• velocyto.R包进行RNA速度分析，推断细胞分化轨迹；
• pySCENIC进行转录因子调控网络分析，鉴定关键转录因子；
• AddModuleScore函数进行基因集signature评分。

空间转录组测序

• Space Ranger完成原始数据的质量控制和比对；
• Seurat包过滤低质量spots，进行数据标准化；
• 主成分分析后进行聚类分析，结合单细胞转录组的signature进行spots注释；
• SpatialFeaturePlot函数绘制基因和signature的空间表达图谱；
• AddModuleScore函数进行细胞亚型signature评分，分析共定位特征；
• 进行基因本体论富集分析，解析特定聚类的功能通路。

批量RNA测序与基因芯片

• 基于单细胞RNA测序的细胞注释结果，利用CIBERSORTx构建细胞类型参考特征矩阵；
• 通过该矩阵反推批量RNA测序和基因芯片数据中的细胞类型浸润比例；
• 进行Spearman相关性分析，解析细胞类型间的浸润相关性；
• 结合临床数据，分析细胞浸润与患者生存的关联；
• 进行基因集富集分析，解析不同细胞浸润特征下的通路富集情况。

组学联合分析

• 整合单细胞RNA测序的细胞亚型特征与空间转录组的空间定位信息，验证FAP+成纤维细胞与SPP1+巨噬细胞的共定位特征；
• 结合单细胞RNA测序的基因表达数据，利用NicheNet包分析FAP+成纤维细胞与SPP1+巨噬细胞间的配体-受体相互作用，鉴定关键调控分子；
• 整合批量测序的临床队列数据与单细胞测序的细胞亚型特征，验证细胞浸润的临床相关性；
• 结合免疫治疗队列的基因表达和临床数据，分析FAP/SPP1表达与免疫治疗疗效的关系。

统计分析

• 采用配对双侧Wilcoxon符号秩检验比较肿瘤与癌旁组织的通路富集和细胞比例差异；
• 配对双侧Student’s t检验比较肿瘤与癌旁组织的细胞亚型比例、分子表达水平差异；
• Spearman相关性分析解析细胞类型间的浸润相关性，以|Rs|>0.3且FDR<0.05为显著相关；
• log-rank检验分析细胞浸润/基因表达与患者生存的相关性；
• Cox比例风险模型计算风险比及95%置信区间；
• one-way ANOVA检验比较不同细胞浸润亚组的分子特征差异；
• Fisher’s检验进行基因本体论富集分析和免疫治疗响应率的组间比较；
• 非配对双侧Student’s t检验比较健康人与结直肠癌患者的血浆趋化素水平。

所有统计分析以p<0.05为差异具有统计学意义。

总结

研究意义

本研究首次系统解析了结直肠癌中FAP+成纤维细胞与SPP1+巨噬细胞的肿瘤特异性特征、分化调控机制及二者的相互作用模式，明确了该相互作用在构建免疫排斥性肿瘤微环境、促进促纤维增生结构形成中的关键作用，揭示了FAP/SPP1高表达与结直肠癌患者免疫治疗耐药的相关性。研究为结直肠癌肿瘤微环境的调控机制提供了新的视角，提出了通过破坏FAP+成纤维细胞与SPP1+巨噬细胞相互作用来改善免疫治疗疗效的潜在策略，为结直肠癌的精准免疫治疗提供了新的靶点和理论依据。

文章复现

这篇文章的原始数据和生信分析代码都公开了，非常全面。

原始数据：

• 单细胞RNA测序和空间转录组测序原始数据存档于基因组序列档案库，登录号为HRA000979；
• 结直肠癌公共单细胞转录组数据下载自GEO数据库，编号包括GSE146771、GSE132465、GSE144735；TCGA数据库获取结直肠癌批量RNA测序数据；
• GEO数据库获取结直肠癌基因芯片数据，编号包括GSE41568、GSE39582、GSE37892等；
• 免疫治疗数据来自IMvigor210队列。

生信分析代码：

• 代码基于R 3.6.0实现，仓库地址为https://github.com/youqiongye/CRC_scRNAseq/tree/V1.0.0。