凝胶迁移实验（EMSA）技术原理与操作指南

一、概述与基本原理

凝胶迁移实验，又称电泳迁移率实验（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA），是研究核酸结合蛋白与特定核酸序列相互作用的核心技术之一，兼具定性与定量分析功能。该方法最初应用于DNA结合蛋白的研究，目前也已广泛应用于RNA结合蛋白与RNA序列互作的解析。

其基本原理为：将纯化或部分纯化的蛋白（或细胞抽提液）与经同位素（如³²P）标记的DNA或RNA探针共同孵育，随后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。由于蛋白-核酸复合物的分子量大于游离探针，其在凝胶中的迁移速率显著降低，从而通过放射自显影实现复合物与游离探针的可视化分离。根据蛋白来源及实验目的，探针可为双链或单链形式，样本可采用核抽提物或胞质抽提物。在竞争实验中，通过加入特异性或非特异性未标记探针，可根据复合物条带的强度变化判断结合的特异性。

二、主要应用目的

① 鉴定特定转录因子及其识别的顺式作用元件；
② 评估蛋白质与DNA序列结合的亲和力与特异性；
③ 分析探针序列突变对蛋白结合能力的影响；
④ 辅助DNA足印迹（DNA-footprinting）实验，定位蛋白结合的关键碱基区域。

三、操作流程

本实验采用Thermo Fisher（Pierce）公司EMSA试剂盒，主要操作步骤如下：

（一）探针标记与处理
① 冰上解冻标记试剂盒各组分（TdT酶除外）；
② 使用1×TdT反应缓冲液将TdT酶稀释至工作浓度（2 U/μL）；
③ 按试剂盒说明书配制50 μL标记反应体系，于37 °C孵育30 min；

④ 加入2.5 μL 0.2 M EDTA终止标记反应；
⑤ 加入50 μL氯仿-异戊醇（24:1）抽提去除TdT酶，振荡后离心，取上层水相；
⑥ 评估探针标记效率；
⑦ 与互补链退火，退火产物可直接用于EMSA实验或于-20 °C冻存备用。

（二）EMSA结合与电泳分离
① 制备4%–6%非变性聚丙烯酰胺凝胶，100 V电压下预电泳；
② 按实验设计配制20 μL结合反应体系，依次加入各组分；

③ 加样后以60 V电压电泳，至溴酚蓝指示带迁移至凝胶约2/3处停止。

（三）转膜与化学发光检测
① 采用半干转膜仪，380 mA恒流转膜1 h，将核酸转移至尼龙膜；
② 膜封闭：室温下于Blocking Buffer中轻摇孵育15 min；
③ 抗体孵育：更换为含偶联物的Blocking Buffer工作液，室温轻摇15 min；
④ 洗涤：用1×Washing Buffer洗涤膜4次，每次5 min，室温轻摇；
⑤ 平衡：将膜转移至Substrate Equilibration Buffer中，室温轻摇5 min；
⑥ 显色：避光条件下配制Substrate Working Solution，将膜浸入孵育5 min；
⑦ 取出膜，吸去多余液体，用保鲜膜包裹（避免褶皱），置于暗室内进行X光片曝光及记录结果。