【云克隆原创】大鼠睾丸支持细胞（Primary Rat Sertoli Cells ）的原代分离与鉴定 Protocol

大鼠睾丸支持细胞SEC的原代分离与鉴定

一、简介：

①睾丸组织中的细胞包括支持细胞、间质细胞和生精细胞。睾丸支持细胞在精子发生和成熟过程中起着重要作用，具有支持、保护和营养生精细胞作用，促雄激素结合蛋白(Androgen binding protein，ABP) 合成，ABP 可与雄激素结合，以保持生精小管内雄激素的水平，促进精子发生。支持细胞与干细胞体外共同培养，能促进干细胞的生长，可能与支持细胞能够分泌多种促细胞生长物质有关

② 体外培养分离的支持细胞形态支持细胞呈椭圆形，并长出多个突起，核仁和胞质内有颗粒物质。支持细胞经HE 染色后，呈不规则形状或辐射状，有多个粗大的突起。细胞核染成深色，细胞质丰富，染成淡红色；油红O 染色后，细胞核染成蓝色。细胞质中有许多被染成红色的大小不一圆形细胞脂质小滴；Feulgen染色后，细胞质未着色，细胞核淡染为紫红色，其内可见一个至数个着色较深的紫红色颗粒即为核仁周围的卫星小体。

胰蛋白酶-胶原酶混合消化法

二、材料：

1、实验动物：2-3周龄（15-21天）左右的SD大鼠（雄性）

2、组织来源：睾丸

3、手术器材：手术剪（镊）、解剖镊、眼科剪（镊）

4、消化酶：Ⅳ型胶原酶（sigma，Cat#: C5138）, 0.25%胰酶（翊圣，Cat#: 40101ES25）

5、培养基： DMEM/F12+15%FBS+1%双抗

三、实验步骤

1. 取15-21ｄ的雄性SD大鼠，采用颈椎脱臼法处死，全身于75％酒精中浸泡3-5min。

2. 无菌操作取睾丸，并置于预先加入2%双抗的无菌PBS的培养皿中，用PBS清洗2次，去掉睾丸表面黏液和血液，用眼科剪和眼科镊去除睾丸被膜及睾丸实质中的血管。

3. 将踢除干净的睾丸实质转移至另一个培养皿中，加入3-5ml PBS，用眼科剪将睾丸实质剪碎大约为1 mm³的碎块，静置3min-5min，用移液枪将上清液弃去（目的是去除间质细胞）。

4. 将睾丸实质碎块转移至15ml的离心管中，加入相当于离心管中睾丸实质４倍体积的0.25%胰酶（5ml），轻轻震荡，使睾丸实质中的曲精小管散开；37℃水浴中消化5-10min，期间每隔2min震荡一次，观察组织碎块消化成线索状，加入等体积的完全培养基终止消化，1000rpm离心5min，弃上清液，再加5ml的PBS，用移液枪轻轻吹打悬浮细胞，1000rpm离心5min，弃上清液。（上清液可再次离心收集细胞，铺6孔板）

5. 加入相当于离心管中睾丸实质４倍体积的0.1％的Ⅳ型胶原酶(5ml)，37℃水浴消化10min，每隔2min震荡一次，观察组织变成黏液状（镜下可完成大量的细胞爬出），再加入等体积的完成培养基终止消化，经100目网筛过滤，收集细胞滤液，800rpm离心5min，弃上清液，加入含15%FBS的DMEM/F12完全培养基重悬，接种于T25培养瓶（大概可铺5个T25培养瓶），放入培养箱中进行培养24小时。

6. 24h后取出培养瓶，弃掉培养液，用PBS清洗２次。用20mmol/LPH7.4的Tris-Hcl低渗处理2-5 min，去除精原细胞。再用PBS或者培养基洗2次，加含15％FBS 的DMEM/F12 培养基继续培养。

7.每隔24 h观察细胞生长状态，每隔48 h 换培养液一次，待细胞长满至80%以上，可进行传代。

四、各阶段的大鼠睾丸支持细胞照片（白光）

图1 消化过程中，可见生精小管周围有大量的细胞（100X）

图2 消化完成并过筛后，得到的细胞（100X）

图3 原代培养24小时的大鼠睾丸支持细胞（100X）

图4 原代培养48小时的大鼠睾丸支持细胞（100X）

图5 传代后的大鼠睾丸支持细胞（100X）

图6 传代后的大鼠睾丸支持细胞（200X）

五、大鼠睾丸支持细胞的鉴定

常用鉴定方法：

①HE染色：观察细胞的形态和双核结构（睾丸支持细胞是双核的）

②油红O染色

③甲基绿－派洛宁染色：

④Feulgen染色：主要用来检测细胞核中的卫星核小体

⑤Vimentin、ABP免疫荧光鉴定

图. 云克隆大鼠睾丸支持细胞免疫荧光鉴定图（Vimentin抗体）

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