WB 内参关键：管家基因稳定性、分子量匹配及实验条件适配_ MedChemExpress (MCE)

Section.01

什么是内参？

内参(Internal Control/Reference) ：是指在科研实验中作为基准参照物的一类分子，通常是蛋白质或 RNA。它们由管家基因编码，在各种细胞或组织中恒定表达，不受实验处理的影响。

内参拥有两大核心特质：稳定性强、丰度高。

Section.02

不加内参？绝对不行！

内参并不是“凑数条带”，没有规范内参的定量实验，基本等于无效实验。

作用一：空白对照

内参可作为空白对照，评估实验全流程。基于内参稳定性强、丰度高且稳定的特性，正常情况下，内参是一定能跑出来的！如果内参条带清晰、整齐，说明你的样品处理、电泳、转膜、发光这些步骤都没问题。

作用二：校正误差

实验中需要确保各个加样孔的蛋白上样量一致，排除因加样体积偏差或蛋白定量不准导致的假阳性/假阴性。

正常情况下，显色后，各个孔的内参条带在肉眼观察下宽度一致、灰度值(或荧光强度)相近，这可直观表明每个泳道 (加样孔) 的总蛋白转膜量大致相同。

若内参条带存在不清晰、缺失或深浅不一的情况，说明实验本身存在问题，需要先回溯排查实验步骤。

图 1. 内参条带的校正作用[1]。

注意！！！校正看的是蛋白总质量，不是上样体积！体积一致 ≠ 上样量一致。

作用三：归一化定量

肉眼看条带深浅，只能叫“感觉有差异”，不能叫“统计学差异”。所有正规 SCI 定量结果，必须经过归一化(Normalize)校正：

WB 相对表达量 = 目的蛋白灰度值 ÷ 同泳道内参灰度值

图 2. 肝组织中 ETV4 和 β-Actin 的蛋白水平，统计数据为平均值[2]。

当然，部分文献的 WB 结果图下方还会附加一张柱状图，纵坐标即为“相对灰度值”，可以清晰直观地展示出实验组与对照组之间的表达差异。

图 3. LOXL1 和 GAPDH 的蛋白水平，统计数据为平均值[3]。

Buttttt，没有任何一款内参是完美的!

内参并不是随便选一个就能用的。针对不同的实验条件、不同的组织样本以及不同的靶标蛋白，内参的选择都有相应的讲究。

Section.03

如何根据自身实验选内参？

原则上，内参的选择是要根据目的蛋白的分子量大小以及样本类型来定。

分子量错开

分子量最好相差 5 kDa 以上。

内参与目的蛋白分子量太近，条带会粘连、重叠，无法单独抠灰度定量；差距太大又会导致电泳分离过度，不在同一张膜有效区间。相差 5 kDa 以上最稳妥。

样本种属匹配

哺乳动物细胞/组织 (如人、小鼠、大鼠) 可选择 GAPDH、β-Actin 等；

植物样本则选择 Plant Actin 等；

其他稀少物种：参照已发表文献，选择高度保守的管家基因表达蛋白作为内参。

与实验条件适配

首先要考虑的是，你的实验处理是否影响内参？例如，某些特定的药物处理或缺氧实验可能会改变 GAPDH 的表达，此时建议使用 β-Actin 。

其次，还要考虑目的蛋白的表达部位。例如核蛋白的内参要考虑用 Lamin A，Lamin B，Histone H3 等；膜蛋白的内参一般用 N-Cadherin。

表 1. 不同表达部位常用内参。

Section.04

内参“锦囊”：实验场景

磷酸化蛋白检测

磷酸化蛋白检测需使用双内参！！！

1. 常规内参：作为实验体系的对照，如 GAPDH 等。

2.磷酸化蛋白对应的总蛋白：如检测 p-Akt 时，一定要同时检测 Total-Akt。 因为磷酸化蛋白条带变强弱，可能是总蛋白量变了，不是磷酸化水平变了，需要用总蛋白进行校正。

图 4. 不同处理条件下，p-EGFR 与 Total-EGFR 表达的 WB 分析[4]。

缺氧/诱导糖尿病等因素

在进行缺氧或诱导糖尿病等处理时，GAPDH 的表达水平会发生显著增高，不适合作为内参[5]。 此时，可按需选择使用 β-actin、α-Tubulin 或 Lamin B 做内参。

1. 缺氧环境：细胞在缺氧条件下，为维持能量代谢，会启动代偿机制来增强糖酵解途径。作为糖酵解的关键酶，GAPDH 的表达量会被显著上调。

图 5. 慢性缺氧条件下 (HX)，GAPDH 表达量显著上调[5]。

2. 诱导糖尿病：在高糖环境或糖尿病模型中，细胞的代谢途径，特别是葡萄糖代谢，发生剧烈改变，直接影响 GAPDH 的代谢活性和表达水平。

图 6. 对照组和糖尿病患者 (n = 3) 胰腺组织蛋白 SOX9 和 NGN3 的 Western blot 结果[6]。

此外，部分抗癌和真菌药物处理时，Tubulin 表达会受影响,不适合作为内参。Tubulin 是细胞骨架的主要成分，而许多抗癌药物 (如紫杉醇、长春碱) 和抗真菌药物 (如灰黄霉素) 的作用机制正是通过靶向结合微管蛋白来干扰细胞分裂。因此，这类药物处理会直接改变 Tubulin 的表达量或聚合状态，导致其无法作为稳定的内参蛋白。此时，可尝试选择 β-actin、GAPDH、Histone H3 或 Lamin B 做内参。

细胞功能或状态变化

1. 细胞增殖实验：c-Jun 自身表达会变化，不适合作为内参[9]。

2. 凋亡实验：TBP、Lamin 在凋亡过程中表达或定位会变化，不适合作为核内参。

图 9. 细胞凋亡 (细胞凋亡水平 RM>HM) 对 TBP 表达量的影响[10]。

组织特异性

(1) 脂肪组织：β-Actin 的表达量非常低，不适合作为内参。

(2) 多组织多细胞样本对比：GAPDH 作为代谢类蛋白，在活组织中表达比较恒定，因此多组织多细胞样本对比时，建议选用 GAPDH 作内参[11]。β-Actin 和 β-Tubulin 等结构蛋白在不同组织中会有表达差异。

(3) 细胞骨架相关的蛋白研究，不适合用 β-actin 作为内参，因为细胞骨架的重组可能会影响 β-actin 的表达。

特殊组织、样本的内参选择

(1) 骨骼肌、心肌、平滑肌：Tubulin 表达改变，不适合作为内参。

(2) 血浆、乳汁、组织液等分泌样本：由于没有完整的细胞结构，可选择分泌型蛋白如 Transferrin 作内参。

下面是小 M 给大家整理汇总了常用内参！建议一键收藏，随时翻看~

表 2. 常见内参选择汇总。

Section.05

小结

总之，科研路上无捷径，内参选择亦是如此！小 M 在这里提醒大家：多查阅同领域、同实验条件的相关文献，再用预实验把关，用心做好每一步，实验之路才能顺顺利利！！

参考文献

[1] Hou Y, et al. SMPDL3A is a cGAMP-degrading enzyme induced by LXR-mediated lipid metabolism to restrict cGAS-STING DNA sensing Immunity, 2023; 56, 2492-2507.e10

[2] Xue X, et al. Hyodeoxycholic acid ameliorates cholestatic liver fibrosis by facilitating m6A-regulated expression of a novel anti-fibrotic target ETV4. J Hepatol. 2025 Jul;83(1):52-69.

[3] Xuzhen Yan, et al. Selective inhibition of hepatic stellate cell and fibroblast-derived LOXL1 attenuates BDL- and Mdr2−/−-induced cholestatic liver fibrosis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology 2023 325:6.

[4] Wang M, et al. Gefitinib and fostamatinib target EGFR and SYK to attenuate silicosis: a multi-omics study with drug exploration. Signal Transduct Target Ther. 2022 May 13;7(1):157.

[5] Liu Q , et al. Danen EHJ, Le Dévédec SE. Differential response of luminal and basal breast cancer cells to acute and chronic hypoxia. Breast Cancer Res Treat. 2023 Apr;198(3):583-596.

[6] Chen XY, et al. SDF-1 inhibits the dedifferentiation of islet β cells in hyperglycaemia by up-regulating FoxO1 via binding to CXCR4. J Cell Mol Med. 2022 Feb;26(3):750-763.

[7] Wu X, et al. The small molecule CS1 inhibits mitosis and sister chromatid resolution in HeLa cells. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 2018 May;1862(5):1134-1147.

[8] 车迪, 等. 紫杉醇联合ipatasertib对口腔鳞状细胞癌细胞死亡、增殖及自噬的影响[J]. 《口腔颌面外科杂志》, 2025, 35(1): 28-33.

[9] Wu Y, et al. Overexpression of Krüppel-Like Factor 4 Suppresses Migration and Invasion of Non-Small Cell Lung Cancer Through c-Jun-NH2-Terminal Kinase/Epithelial-Mesenchymal Transition Signaling Pathway. Front Pharmacol. 2020 Jan 8;10:1512.

[10] Zhao J, et al. The novel lnc-HZ12 suppresses autophagy degradation of BBC3 by preventing its interactions with HSPA8 to induce trophoblast cell apoptosis. Autophagy. 2024 Oct;20(10):2255-2274.

[11] Ren G, et al. Selection and validation of reference genes for qPCR analysis of differentiation and maturation of THP-1 cells into M1 macrophage-like cells. Immunol Cell Biol. 2022 Nov;100(10):822-829.