RIP-seq技术流程

1简介

RIP-seq（RNA Immunoprecipitation sequencing）是一种细胞内检测蛋白质所结合RNA的技术，通过特异性抗体对RNA结合蛋白（RBP）进行免疫共沉淀，分离与其结合的RNA，随后通过高通量测序获取全转录组范围内与该蛋白结合的RNA序列信息，从而解析蛋白-RNA相互作用网络【1】。其原理类似于ChIP-seq（染色质免疫沉淀测序），但研究对象由DNA转为RNA，有助于发现特定蛋白的RNA靶标及转录后调控网络动态过程。

2 实验流程

（1）细胞裂解：使细胞内的RNA-蛋白质复合物释放到裂解液中，在裂解过程中，须维持适当的条件，以保证这些复合物的完整性，防止其解离；

（2）免疫沉淀：向细胞裂解液中加入针对目标蛋白的特异性抗体。该抗体能够特异识别并结合目标蛋白，从而形成“抗体-目标蛋白-RNA”的三元复合物。随后，加入与抗体特异性结合的磁珠，使上述三元复合物通过抗体与磁珠结合并沉淀下来。经过多次洗涤步骤，去除未结合的杂质（如其他蛋白质、RNA和小分子物质等），从而富集出含有目标蛋白结合的RNA复合物。

(3) RNA的释放与纯化：使用蛋白酶K等试剂处理免疫沉淀得到的复合物，消化蛋白质成分，使RNA从“RNA-蛋白质”复合物中释放出来。随后，通过一系列纯化步骤去除蛋白质消化产物、盐离子和其他杂质等，得到纯净的RNA。

(4) 文库构建：对纯化后的RNA进行文库构建，将RNA反转录成cDNA，然后在cDNA两端添加特定的接头序列，构建成适合高通量测序平台的文库。

(5) 高通量测序：将构建好的文库在Illumina高通量测序平台上进行测序，从而获得大量的测序读段。

3 数据分析流程

(1) 测序数据质控；

(2) 与参考基因组序列比对, 统计样品Uniquely mapped reads在基因上、基因间区的分布情况及覆盖深度；

(3) Peak calling，统计样品Peak信息（峰检测及计数、平均峰长度、峰长中位数）；

(4) 给出每个样品Peak关联基因列表及GO和KEGG功能注释；

(5) peak的富集motif分析，找到蛋白结合序列的保守motif；

(6) 在多个样品间，对Peak进行差异分析。

4应用领域

(1) 广泛用于研究mRNA、lncRNA及其他非编码RNA与蛋白的相互作用;

(2) 揭示基因调控机制;

(3) 发现潜在的疾病标志物或治疗靶点[3]。

5参考文献

1、 Zhao, Jing, Toshiro K. Ohsumi, Johnny T. Kung, Yuya Ogawa, Daniel J. Grau, Kavitha Sarma, Ji Joon Song, Robert E. Kingston, Mark Borowsky, and Jeannie T. Lee. "Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq." Molecular cell 40, no. 6 (2010): 939-953.

2、 Zambelli, Federico, and Giulio Pavesi. "RIP-Seq data analysis to determine RNA–protein associations." In RNA Bioinformatics, pp. 293-303. New York, NY: Springer New York, 2014.

3、 Zheng, Xin, Shenggang Li, Ju Yu, Chungang Dai, Suji Yan, Gang Chen, and Chao Sun. "N6-methyladenosine reader IGF2BP3 as a prognostic Biomarker contribute to malignant progression of glioma." Translational cancer research 12, no. 4 (2023): 992.