卡梅德生物技术快报｜人源scFv抗体蛋白：人源scFv抗体蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达优化策略

1. 问题提出：scFv在大肠杆菌表达中的"包涵体困境"

人源scFv抗体蛋白因分子量小（约25-30 kDa）、不含Fc糖基化依赖片段，理论上可在原核系统——大肠杆菌中实现高效表达。然而，实际工作中一个普遍问题是：scFv在E. coli BL21(DE3)等常用菌株中诱导表达后，大量产物以不溶性包涵体形式沉淀，可溶性组分占比低，严重影响后续纯化和活性回收。

以b12-scFv为例，在pET28a载体转入BL21 Star™(DE3)并经IPTG诱导后，SDS-PAGE显示表达产物虽然分子量约29 kDa与预测一致，但可溶性蛋白与包涵体并存。更典型的场景是原始表达的scFv几乎全部聚集为包涵体，需要复杂的变复性流程才能获得活性产物。

2. 原因分析：为什么scFv容易聚集？

从分子层面看，scFv的聚集原因包括：（1）scFv缺少完整抗体的恒定区框架支撑，VH与VL之间的正确折叠完全依赖连接肽的物理连接和分子内相互作用力；（2）VH和VL表面的疏水区域在表达过程中容易暴露，若新生肽链折叠速度跟不上表达速度，便发生分子间聚集；（3）大肠杆菌胞质内的还原性环境不利于二硫键的正确形成，而某些scFv构象依赖链内二硫键维持。

3. 解决策略一：SUMO标签融合表达

SUMO（small ubiquitin-related modifier）融合标签可以显著提高scFv的可溶性表达水平。李镇生等利用SUMO蛋白酶Ulp1高效切割SUMO融合蛋白，在N端和C端添加His₆标签，构建重组表达载体psvT7-ulp1，转入大肠杆菌BL21(DE3)后优化诱导条件，Ulp1纯度达95%以上。利用Ulp1切割SUMO融合表达体系，成功获得高纯度、可溶性scFv。

操作要点：将scFv基因构建至pET-SUMO载体中，转化至BL21(DE3)，在16-25℃、0.1-0.5 mM IPTG条件下低温低速诱导过夜，可显著减少包涵体形成。

4. 解决策略二：响应面法（RSM）优化表达条件

当scFv倾向于形成包涵体时，可以通过Box-Behnken设计对诱导温度、诱导时间、IPTG浓度三因素进行系统优化。以anti-MICA scFv为例，研究者设计了15个实验组合，测定不同条件下可溶性蛋白产量，从响应面模型中寻找最优条件。结果显示，不同蛋白的最佳条件各不相同，但针对anti-MICA scFv，最优组合下可溶性产量可达约1.1 mg/mL。

关键参数范围参考：

• 诱导温度：16-30℃（低温有利于可溶性折叠）
• IPTG浓度：0.05-0.5 mM（低浓度降低表达速率）
• 诱导时间：6-16 h（需根据菌株生长曲线调整）

5. 解决策略三：包涵体温和复性

在无法避免包涵体生成时，温和溶解+缓慢柱上重折叠是获得活性scFv的可靠替代策略。具体操作参考α-突触核蛋白原纤维特异性scFv-F的方案：采用100 mM Tris（pH 12.5）和2 M尿素的温和条件溶解包涵体，然后通过缓慢柱上重折叠法获得活性scFv-F。

相比传统的6-8 M尿素或盐酸胍强变性复性，温和溶解策略的优势在于保留更多的局部结构信息，有利于复性效率的提升。2024年发表的研究也支持"排除强变性协议，采用温和或自发溶解策略"的导向。

6. 效果验证：数据对比

7. 操作建议

针对人源scFv抗体蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达，建议按以下优先级逐步尝试：
1⃣ 优先尝试低温诱导（16-22℃）+ 低浓度IPTG（0.1-0.3 mM）
2⃣ 若效果不佳，将scFv基因构建至SUMO或MBP融合载体
3⃣ 若仍有大量包涵体，采用响应面法系统优化三个关键参数
4⃣ 最终方案：可接受包涵体表达时，采用温和复性策略获得活性产物

📚参考文献：
[1] 焦子琛等. 单链抗体的新研究进展及其在医学中的应用[J]. 2024.
[2] 杨雄等. HIV-1可溶性单链抗体b12-scFv的表达与活性分析[J]. 2014.
[3] 可溶性蛋白原核表达全攻略. Nebulabio, 2025.
[4] SUMO蛋白酶Ulp1高效表达纯化并通过His-SUMO标签制备scFv. 2023.
[5] Gupta V et al. α-synuclein fibril-specific scFv表达、纯化和鉴定. 2020.
[6] 包涵体蛋白纯化综述. 2024.