质粒提取实验
合成生物学系列第一弹～质粒提取实验
前言
合成生物学是目前研究的热点之一，也是众多养菌人重点的shui论文方向（bushi）身为一个养菌人，终于大学毕业了，为了更好的激励我自己系统性的梳理一遍我的知识网，我会给大家从上游到下游，从实验设计，实验操作，生信分析等多角度进行树立，从宏观到微观展示给大家，下面是我目前整理的流程图，后期可能还会更新变动。
先划重点：质粒提取的核心是把细菌里的环状质粒DNA和基因组DNA、蛋白、RNA等杂质分离开，拿到纯净的质粒，为后续分子克隆、基因编辑、测序等实验铺路
简单说：提得好=实验成功一半，提崩了=半天功夫全白费
耗时
- 30-40min
主要实验器材
- 单通道移液枪
- 金属浴
- 高速离心机
主要试剂
- omega质粒小提试剂盒
实验流程
- 菌液在摇床中生长至对数期
- 将培养的菌液8000×g离心3min
- 4℃冰箱中保存的Solution I拿出，用移液枪吸取250μL，加入离心管中，并吹吸混匀以重悬菌体，并将重悬后液体转移至1.5mL EP管中
- 加入250μL Solution II，多次颠倒混匀，静置3min
- 加入300μL Solution III，立减颠倒至白色絮状物出现，13000×g离心10min
- 取上清700μL转移至吸附柱中，13000×g离心1min，弃液
- 在吸附柱中加入500μL HBC Buffer，13000×g离心1min，弃液
- 加入700μL DNA Wash Buffer，13000×g离心1min，并重复
- 60℃金属浴中开盖静置6min以提高提取率，并提前将ddH2O放置在金属浴上
- 吸附柱放置1.5mL EP管上，在吸附柱中心白色处加入50μL ddH2O，静置1min后13000×g离心1min
- NanoDrop取2μL液体测提取浓度，保证后续试验
NanoDrop结果解读
| 检测指标 | 理想范围 | 结果解读 | 异常原因 & 处理方案 |
|---|---|---|---|
| 质粒浓度 | ≥50ng/μL | 浓度合格，能满足后续酶切、克隆、测序等实验需求 | 浓度偏低（/μL）：① 菌液量太少 / 摇菌不足→下次加 2mL 菌液； 洗脱不充分→按 “点涂法” 加 ddH2O，可重复洗脱 1 次；③ 吸附柱失效→换全新试剂盒 |
| A260/A280 | 1.8-2.0 | 纯度合格，几乎无蛋白污染 | 低于 1.8（蛋白污染）：① 吸上清时吸到沉淀→下次少吸 50-100μL；② HBC Buffer 洗涤不充分→增加 1 次 HBC Buffer 洗涤；> 高于 2.0（RNA 污染）：>① 试剂盒无 RNase→加少量 RNase A（终浓度 10μg/mL）37℃孵育 15min，重新纯化 |
| A260/A270 | 1.5-1.8 | 无酚类杂质污染 | 低于 1.5（酚污染）：>① 洗涤步骤省略→严格按流程洗 2 次； DNA Wash Buffer 忘加乙醇→补加乙醇后重新洗涤 |
实验小tips
- 第1步摇菌时间根据菌株来定，比较常用的大肠杆菌是8h。
- 第4步有在不同情况下有一些不同的操作技巧。第一种情况是样本不多的情况，这里的颠倒可以改成在EP管架上不同孔间摩擦管底以混匀。如果是样品较多，可以用两个EP管架夹住管顶管底，颠倒混匀。
- 其实第4步主要目的是把白色的蛋白杂质沉下来，根据我的经验，其实10min一般这个蛋白沉淀的也不会特别好，用枪头吸的时候离的近了该吸还是会吸上来，我大概缩短了时间试了几遍，其实大概5min到7min就差不多了，当然如果你是要送去测序最好还是按标准做，主要怕送测序公司时间比较长，怕蛋白污染太严重。如果只是要做点突的话就还好，你甚至可以少吸一点，反正后面还要PCR。
- 第9步这里，最重要的点其实是加的水一定要滴在吸附柱的那层树脂上，枪头一定要挨上，因为这一步是为了把吸附柱的质粒溶在水里离下来，通常加的体积又比较小，不容易加进去，所以一定要注意。另外如果贴上之后水因为太紧打不出去的话，教大家一个小技巧，就是可以用枪头打一点在柱子上，然后抬起来一下，然后再贴上去，一点一点把水打到柱子上，那个白色的部分会把水吸住。最开始课上做这个实验的时候班里几乎所有人都败下，其实就是因为这一步没做好，导致提出来的浓度很低。
- 如果你提取的质粒后面会用去做同源重组（比如Gibson）质粒的浓度通常在50-120ng/μL即可，与目的基因的浓度差距越大（无论是浓度过低还是浓度过高）需要做出体积变化越大，不利于加样过程。如果用PCR仪做定点突变，浓度要求会更低一些，只需调整质粒及模板体积即可。
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