Cell |重测序使用近缘参考基因组，结果偏差有多大？

Q：没有参考基因组怎么做重测序分析？

A:一般会使用近缘参考基因组。

Q:使用近缘参考基因组，会影响分析结果吗？

A:Cell给您答案！

实验设计

研究对象：美国东部、西部各6只灰狐；

参考基因组：灰狐（同种），北极狐、家犬基因组（同科）

评估指标：遗传变异检测、有效群体大小、重组率、核苷酸多样性（π）和遗传分化等

主要研究结果

1、同种参考基因组有很高的Mapping率

使用同种参考基因组，mapping率更高（99.7%）；同科参考基因组，未映射reads则富含参与感官感知和免疫的基因，这表明在使用近缘参考序列时，会系统性地排除具有功能重要性的区域。

表1 每个参考基因组和群体的成功定位reads总数、SNPs数量和杂合度估计值

2、同种参考基因组产生更多的SNP和罕见的变异

同种参考基因组能检测到更多的 SNP和singleton（罕见变异），比同科参考基因组多出 26%- 32%。同科参考基因组识别出的SNP中有 80% 在同种参考基因组下也被识别为SNP，对于未能转换为SNP的变异位点，其中大部分在灰狐基因组中未被识别为任何类型的变异。这些位点中约有一半映射到不变位点，而另一半则完全无法映射。

图1 参考偏差影响变异检测

3、同种参考基因组导致更高的有效种群大小估计值

与同科参考基因组相比，同种参考基因组显示其有效种群数量（Ne）随时间变化的波动较小，且总体估计值较高，尤其是西部种群；为减少参考偏差，研究屏蔽了未能映射的 SNP，通过下采样验证，发现轨迹差异不仅由变异类型差异引起，还受有效位点数量的影响。

分析软件也会影响评估值，MSMC2和 stairway plot 2 在东部种群的推断差异较大，且对异源参考基因组更为敏感。

图2 参考偏差影响有效种群大小估计值

4、参考基因组的选择影响着重组率推断

在东部，使用北极狐参考基因组导致重组率被低估；使用狗参考基因组导致重组率被高估；在西部，使用同科参考基因组，重组率被高估。染色体50 kb窗口的Loess平滑重组率高估主要发生在染色体末端。

图3 灰狐种群间参考基因组重组率比较

5、同科参考基因组低估了多样性和分化

与同科参考基因组相比，同种基因组给出更高的核苷酸多样性（π）值；使用同种基因组时，种群间差异更大，且两个种群相关性最强。

图4 东部和西部灰狐种群的多样性和分化估计较高

6、参考基因组选择影响FST异常值检测

不同参考基因组检测出的FST异常值区域存在差异；GO富集分析发现，这些独特的FST异常区域所关联的生物学功能也完全不同。

图5 FST异常值和功能富集分析

思路与讨论

使用近缘参考基因组会导致：忽略重要的功能区域、降低singleton的检出、低估有效种群大小、影响着重组率推断、低估群体多样性和分化、影响FST异常值检测。近缘参考基因组分析结果应谨慎解读。

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参考文献

Reference genome choice compromises population genetic analyses.Cell,2025.