磷酸化蛋白WB没结果？看完这篇文章再说

Wsetern Blot可以说是科研人的必修课，已经修炼的得心应手，但是遇到磷酸化蛋白的WB却开始痛苦面具，一问一个不吱声，接下来小爱带大家深度剖析磷酸化蛋白的WB是怎么个事！

蛋白质磷酸化修饰：

是指在激酶的催化作用下，将ATP的磷酸根基团，转移到蛋白的氨基酸侧链上，这个过程一般是可逆的，可通过磷酸酶去除蛋白磷酸化修饰。蛋白的磷酸化修饰通常发生在丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸上。蛋白质磷酸化的修饰可以改变蛋白质的结构和活性，从而影响细胞的代谢、增殖、分化等生理过程，是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的机制。目前涉及到的主要研究包括，疾病机制研究、细胞信号传导研究、药物研发、发育生物学、应激响应等。

蛋白磷酸化示意图

为什么磷酸化蛋白的WB不好做？

1）磷酸化蛋白的丰度通常较低，大概只有总蛋白量的10%，甚至更低；

2）蛋白磷酸化修饰可逆，细胞一旦裂解，蛋白酶和磷酸酶会立即释放，使磷酸化蛋白质可以在几毫秒内去磷酸化。

磷酸化蛋白WB，慎之又慎

1、实验前准备——充分了解自己的研究对象

一般通过查阅文献或者借助数据库了解研究蛋白的磷酸化位点及水平，这里推荐大家使用PhosphoSitePlus ——蛋白翻译后修饰综合性预测数据库，只需输入蛋白名称，可以查询该蛋白各种修饰类型，以及位点信息，以及其他的数据。对于表达水平较低的，可通过物理或化学方法进行一定的刺激和诱导。

PhosphoSitePlus数据库

2、样品处理，走好第一步

1）样品要新鲜；

2）操作要迅速；

3）试剂器具要预冷，冰上操作；

4）尽量不要用超声波细胞破碎仪处理细胞，组织研磨要提前用液氮预冷研钵；

5）裂解液中一定要有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，缺一不可；

6）注意有的磷酸化蛋白上能不要煮沸，否则会破坏其磷酸化位点；

7）测定浓度后，加入上样buffer，分装，冻存于-80度，避免反复冻融。

3、内参

需要设置两个内参，一个是磷酸化蛋白对应的总蛋白，因为只检测到磷酸化蛋白表达量的变化不能说明问题，只有磷酸化蛋白与总蛋白比值变化了才能说明磷酸化水平的变化；另一个是普通内参，作为体系的对照。但是分孔上样比较时误差还是较大，常用的方法，是用一抗二抗去除液将原先结合上的磷酸化抗体及二抗洗去，然后用同一张膜压总蛋白。然后再洗脱一次，再压内标。

CREB1磷酸化CREB1在模型大鼠PFC的表达

4、上样，量要足

磷酸化蛋白和普通WB相比，磷酸化水平较低，所以上样量要足。

5、封闭，看准再下手

牛奶中含有一种磷蛋白即酪蛋白，会引起高背景，在进行磷酸化蛋白检测时建议使用牛血清白蛋白BSA或无蛋白的封闭剂。当然如果抗体上标注了建议，遵循建议也可以。

6、抗体孵育

因为磷酸化蛋白一抗最好4℃过夜孵育，保证抗体有充分的结合时间，4℃过夜，蛋白抗原不容易从膜上脱落。二抗则室温1h即可。

7、洗涤，这种细节也有讲究

建议初次实验减小洗涤次数和摇床转速，有背景总比孵不出来强，后期可以适当优化，得到比较理想的效果。

参考文献

Pan B, Zhu X, Han B, Weng J, Wang Y, Liu Y. The SIK1/CRTC2/CREB1 and TWIST1/PI3K/Akt/GSK3β signaling pathways mediated by microRNA-25-3p are altered in the schizophrenic rat brain. Front Cell Neurosci. 2023 Jan 20;17:1087335. doi: 10.3389/fncel.2023.1087335. PMID: 36744005; PMCID: PMC9896578.