类器官原代培养无菌预防及细胞房除菌攻略
一、概述
类器官污染是一个老生常谈的事情，尤其是做胃肠道，组织本身带来的菌群数量非常庞大，一旦消毒不到位，就会导致类器官培养失败。上一期我们学习了类器官污染鉴别与除菌攻略，接下来小爱带大家了解类器官原代培养无菌预防及细胞房除菌方案。
二、原代培养无菌预防
1、预防无菌各个环节
2、取样及保存无菌预防
注意无菌性：
1）为预防污染，可在组织保存液中加入1%双抗；
2）组织保存液体积要能浸没整个组织，一般5-10mL；
3）取样瓶要保证无菌，也可以用15mL或50mL无菌离心管当取样管；
4）用酒精棉消毒过的镊子将组织放入含有组织保存液的取样瓶中；
5）手术切除的组织需立即转入含有组织保存液无菌取样瓶中。
保存及运输条件：
1）4℃保存，冰袋运输；
2）越早做，成功率越高，当天做最佳，最晚不超过48h。
3、原代培养试剂抗生素添加指南
抗生素 | 组织保存液 | 缓冲液 | 组织消化液 | 类器官培养基 |
青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液(100×三抗) | 稀释1:50 | 稀释1:25 | 稀释1:50 | 稀释1:100 |
硫酸庆大霉素溶液(10mg/mL) | 稀释1:100 | 稀释1:50 | 稀释1:100 | 稀释1:200 |
备注：
三抗：青霉素10kU/mL，链霉素10mg/mL，两性霉素B25µg/mL。工作浓度稀释100X：青霉素100U/mL，链霉素100ug/mL，两性霉素B 0.25µg/mL。
庆大：10mg/mL。工作浓度200X—20000X：0.5ug/ml-50ug/mL
4、细胞房着装要求
操作细胞培养物前后应洗手。穿戴个人防护设备不仅可保护您免受危险品污染，还可降低皮屑以及衣服上污物和灰尘污染培养物的可能。
正确的穿衣顺序：
1）换专用鞋
2）无尘手套（避免不洁的双手经穿着时沾附于无尘衣上）
3）网帽（带网帽时须确保头发不可暴露于网帽外，之后戴口罩遮住口鼻）
4）无尘服（不要穿棉质衣服(脱落纤维)
5）鞋套
5、超净台试剂布局
适合惯用右手的工作人员的工作台基本布局。惯用左手的工作人员可相应地调整工作台面上物品的摆放位置(图源网络)
超净工作台或安全柜里的物品摆放一般遵循以下右手试用习惯，并可根据特殊实验中增加物品进行相应的改动。
1）在工作台中部开阔区域放置细胞培养容器；
2）移液器置于右前方易于取用的地方；
3）试剂和培养基置于右后方，便于吸取；
4）试管架置于中后部，用于固定其他试剂；
5）小型容器置于左后部，用于盛放废液。
6、人为操作技巧
1）小心取用无菌实验物品，勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，也不要在打开的容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝下放置桌面。
2）每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同也不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以75%酒精擦拭无菌操作台面。操作间隔应让无菌操作台运转10min以上后，再进行下一个细胞株之操作。
3）离心管、冻存管等容器需用抗酒精的标记笔标示内容物名称、操作日期、操作人员姓名。若是细胞传代培养，更需注明目前的代数，以及这是同一代中的第几盘。
三、细胞房除菌方案
细胞房主要做好清洁和消毒工作，小爱汇总了目前细胞房常用的消毒试剂种类及作用原理，供大家了解。
除菌剂种类及作用原理
种类 | 作用原理 | 特点 |
醇类除菌剂 | 乙醇的抗菌原理是使蛋白质变性 | 易挥发，作用时间短；刺激性；易燃 |
含氯除菌剂 | 通过新生态氧的极强氧化性使菌体和病毒的蛋白质变性，从而使病原微生物致死。 | 刺激性；腐蚀性 |
醛类除菌剂 | 使蛋白中的氨基和巯基烷基化来灭活微生物 | 刺激性；致癌性 |
过氧化物类除菌剂 | 通过羟基的强氧化性破坏组成细菌的蛋白质 | 刺激性；腐蚀性 |
含碘除菌剂 | 通过氧化性破坏病原体原浆蛋白的活性基因，并与蛋白质的氨基结合而使其变性沉淀 | 刺激性；腐蚀性 |
酚类除菌剂 | 酚类可裂解并穿透细胞壁，使菌体蛋白凝集沉淀 | 刺激性；易使橡胶制品变脆变硬 |
环氧乙烷除菌剂 | 环氧乙烷与蛋白质分子发生烷基化反应 | 易燃易爆；毒性大 |
双胍类和季铵盐类除菌剂 | 破坏细菌的细胞膜，增加细菌胞浆膜通透性，使菌体胞浆物质外渗 | 无刺激性；无腐蚀性；可生物降解 |
1、仪器设备、物体表面除菌方案
适宜微生物增殖的主要条件是温暖潮湿的地方，比如培养箱、水盘、水浴锅等。
培养箱除菌剂特点：
广谱高效：专门用于清除CO2培养箱内的细菌、真菌及支原体等微生物污染；
安全性高：无刺激，无腐蚀，不挥发；
使用方便：直接喷洒即可，省时省力。
用法：
1、移除细胞后，直接对细胞培养箱的隔板、内壁喷洒适量，也可倒出少许，将脱脂棉球浸泡后擦拭使用；
2、建议一周处理一次，配合培养箱水盘除菌剂使用效果更佳。遇污染爆发时期，如梅雨季节等，可适当增加用量。
细胞房除菌剂特点：
具有很强的抑菌功能，可用于细胞房的污染控制，通过清除细胞房内细菌、真菌及其孢子，可有效防止细胞的污染，从而减少由于细胞污染带来的人力、财力、时间方面的浪费。
用法：
1．直接对细胞房的死角、墙面、空间进行喷洒，也可倒出少许，将脱脂棉球浸泡后擦拭使用。 建议一周处理一次，配合紫外线使用效果更佳。
2．建议每立方米(m³)使用量为5-8mL，如10m2、高3m的房间推荐用量为150mL。遇污染爆发时期，如梅雨季节等，可适当增加用量。若室内墙壁上有霉菌生长，可喷洒于墙壁表面，或者用浸泡后的棉球擦拭。
水盘抑菌剂特点：
用来消毒培养箱中的水盘，可有效杀灭细菌、芽孢、支原体、真菌（酵母菌、霉菌）和病毒；无毒；对不锈钢无腐蚀性；不挥发。
用法：
1）建议每周进行一次系统地清洁和消毒培养箱水盘。
2）稀释100倍即可使用，即将1升水中加入10mL的水盘抑菌剂。
水浴锅抑菌剂特点：
用来消毒水浴锅，可有效杀灭细菌、芽孢、支原体、真菌（酵母菌、霉菌）和病毒。
用法：
1）建议每周进行一次系统地清洁和消毒水浴锅。
2）稀释500倍即可使用，即将1升水中加入2mL的水浴锅防菌剂。
2、细胞房空气消毒方法
空气污染不容小觑，气溶胶污染也是细胞房常见的污染途径，小爱整理了常见的空气消毒方法如下：
灭菌方法 | 作用原理 | 特点 |
紫外线灯杀菌 | 波长在260nm的杀菌力最强，紫外线作用于细胞DNA | 穿透力差；有死角；致癌 |
臭氧灭菌 | 通过臭氧分解的单个氧原子的强氧化性破坏细菌的胞膜蛋白 | 灭菌彻底；残留性小；费用较为昂贵 |
空气过滤(恒温恒湿装置) | 逐次使用不同孔径的滤膜将微生物过滤干净 | 灭菌彻底；无毒；费用较为昂贵 |
3、细胞房地面消毒方法
地面是细胞房最常忽略的地方，通常，脚底带来的微生物污染也是导致细胞房污染爆发的关键因素之一，小爱整理了常用的地面清洁剂，供大家参考。
灭菌剂 | 作用原理 | 特点 |
84消毒液 （次氯酸钠） | 次氯酸钠的水解产物次氯酸进一步分解 形成新生态氧[O]，新生态氧的极强氧化性 使菌体和病毒的蛋白质变性 | 灭菌彻底；残留性小；有腐蚀； 与氨或酸(如洁厕灵)混合时易释放出 有毒氯气 |
新洁尔灭 （苯扎溴铵） | 季铵盐类消毒剂属于阳离子表面活性剂， 能吸附带阴离子的细菌并破坏细菌的细胞膜， 增加细菌胞浆膜通透性。 | 可杀灭常见细菌、真菌；刺激性低； 无腐蚀； |
来苏尔 （甲酚） | 酚类可裂解并穿透细胞壁，使菌体蛋白 凝集沉淀，快速杀灭细胞。 | 可杀灭常见细菌、真菌、刺激性强， 易使橡胶制品变脆变硬 |