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单细胞上游分析实战：从cellranger安装到数据预处理全流程解析

news 2026/7/23 2:53:08

1. 环境准备：从零搭建单细胞分析平台

第一次接触单细胞测序数据分析时，最让人头疼的就是环境配置。记得我刚开始搭建环境时，光是解决各种依赖问题就折腾了整整两天。现在把这些经验总结出来，帮你避开那些坑。

首先需要准备的是conda环境，这是管理生物信息软件的神器。我强烈建议使用清华镜像源，下载速度能快10倍不止。配置方法很简单，在终端依次执行以下命令：

conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/pkgs/free/ conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/pkgs/main/ conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/cloud/bioconda/ conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/cloud/conda-forge/ conda config --set show_channel_urls yes

创建专属环境时，我习惯用Python 3.9版本，这个版本兼容性最好。执行conda create -n scRNA python=3.9创建环境后，记得用conda activate scRNA激活。这里有个小技巧：把激活命令写入.bashrc文件，这样每次打开终端都会自动进入工作环境。

1.1 核心工具安装指南

sra-tools是下载原始数据的必备工具。安装时很多人会纠结要不要加-c bioconda参数，其实现在清华镜像配置好后，直接conda install sra-tools就能搞定。我曾经测试过，加不加-c参数下载速度差别不大。

cellranger的安装稍微麻烦些。建议先在用户目录下创建biosoft文件夹存放软件，比如mkdir ~/biosoft。从10x Genomics官网下载最新版cellranger后，用tar -xzvf cellranger-x.x.x.tar.gz解压。重点来了：临时添加PATH时，一定要用绝对路径：

export PATH=/path/to/cellranger/bin:$PATH

验证是否成功最可靠的方法是which cellranger，能看到完整路径就说明配置正确。不过这个设置只在当前会话有效，要永久生效需要把这行命令加到.bashrc文件里。

2. 参考基因组下载与配置

参考基因组就像单细胞分析的"地图"，选错版本后续分析全完蛋。10x Genomics官方提供了多个版本，新手建议用GRCh38-2020-A这个稳定版。下载命令很简单：

nohup wget "https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz" > download.log 2>&1 &

这个命令用了nohup和后台运行，适合大文件下载。我一般会开个tmux会话，这样即使断网也不会中断下载。下载完成后记得校验md5值，有次我遇到文件损坏，白白浪费了一天时间。

解压后目录结构应该是这样的：

refdata-gex-GRCh38-2020-A/ ├── genes ├── genome └── transcriptome

2.1 不同物种的注意事项

如果你做的是小鼠分析，需要下载mm10版本。有个坑要注意：10x的参考基因组是经过特殊处理的，不能用UCSC或Ensembl的直接替代。我有次偷懒用了Ensembl的基因组，结果cellranger直接报错退出。

对于植物或特殊物种，10x可能没有现成的参考基因组。这时需要用cellranger mkref命令自己构建，这个过程比较麻烦，需要准备gtf和fasta文件。建议先在小数据上测试通过再处理正式数据。

3. 数据下载实战技巧

以GSE150321数据集为例，分享几种我常用的下载方法。这个数据集包含两个样本（SRR11666954和SRR11666955），适合用来练手。

3.1 直接下载法

最简单粗暴的方法就是用wget直接下：

nohup wget https://sra-pub-run-odp.s3.amazonaws.com/sra/SRR11666954/SRR11666954 > download.log 2>&1 &

但这种方法有个缺点：不知道下载进度。我改进的方法是结合pv命令：

wget https://sra... | pv -bep -s 500M > SRR11666954

3.2 prefetch批量下载

当需要下载几十个样本时，prefetch是更好的选择。先准备SRR_Acc_List.txt文件，然后有三种用法：

第一种最简洁：

cat SRR_Acc_List.txt | while read id; do prefetch --max-size 500G "$id"; done

第二种会打印下载状态：

cat SRR_Acc_List.txt | while read i; do prefetch $i --max-size 500G -O `pwd` && echo "**${i}.sra done**" done

第三种适合超大批量：

prefetch --option-file SRR_Acc_List.txt -O ./ --min-size 0 --max-size 500GB

3.3 kingfisher高效方案

最近发现的kingfisher真是神器，一行命令搞定所有：

kingfisher get --run-identifiers-list SRR_Acc_List.txt -m ena-ascp ena-ftp prefetch --download-threads 10 --check-md5sums 1 > down_srr_list.log 2>&1

这个工具会自动尝试多种下载方式，还能校验文件完整性。我测试过，10线程下载比prefetch快3倍以上。

4. 数据预处理关键步骤

下载的sra文件需要转为fastq格式才能用于cellranger。这里推荐用parallel加速处理：

parallel -j 4 'fastq-dump --split-files --gzip {}' ::: *.sra

这个命令会同时处理4个文件，--split-files参数保证配对末端数据正确拆分，--gzip直接压缩节省空间。

4.1 cellranger计数流程

准备好fastq文件后，核心命令长这样：

cellranger count --id=sample1 \ --transcriptome=refdata-gex-GRCh38-2020-A \ --fastqs=path/to/fastq \ --sample=SRR11666954 \ --localcores=16 \ --localmem=64

几个关键参数：