原位测序技术：将测序反应搬回组织切片的原理与应用
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摘要：原位测序技术通过在组织切片上直接进行DNA/RNA测序，将分子信息与空间位置完美结合，实现了真正意义上的“原位基因组学”和“原位转录组学”。本文系统阐述原位测序的技术原理与发展脉络，从早期基于连接法的原位测序（ISS）到基于荧光原位杂交的高通量方法（FISSEQ、STARmap、MERFISH），再到最新的基于聚合酶的原位测序技术。深入解析各种技术的生化原理、检测通量、分辨率及优缺点，重点讨论原位测序在神经科学（脑细胞分型）、发育生物学（胚胎空间图谱）、肿瘤微环境（肿瘤免疫浸润）及临床病理（原位突变检测）中的典型应用。通过对比原位测序与空间转录组（如Visium）、单细胞测序的互补关系，探讨其独特优势（单细胞/亚细胞分辨率、不依赖组织解离）和当前挑战（通量低、背景噪声、数据分析复杂），并展望未来与多组学整合、人工智能图像分析及临床诊断的结合趋势。
关键词：原位测序；空间转录组；FISSEQ；MERFISH；STARmap；组织切片
1. 引言
理解基因表达和基因组变异在组织中的空间分布是生物学和医学的核心目标。传统的测序技术（如RNA-seq、WGS）需要将组织解离成单细胞悬液，丢失了宝贵的空间位置信息。空间转录组技术（如10x Visium）通过空间条形码微阵列恢复了部分空间信息，但分辨率仍受限于spot大小（通常55 μm，约3-10个细胞）。原位测序（In Situ Sequencing, ISS）则迈出了更激进的一步：将测序反应直接搬回组织切片上，在保留组织完整形态的同时，对单个细胞甚至亚细胞结构中的DNA或RNA序列进行直接测定，实现了真正的“原位基因组学”。
原位测序的核心思想：在组织切片上，通过原位扩增和荧光标记的核苷酸掺入，逐轮读取序列信息，最终将每个读段的空间坐标与序列碱基关联。这一概念最早由哈佛大学Church实验室在2005年提出，经过近二十年的发展，形成了多种技术路线，包括：
- 基于连接法的原位测序（ISS）：利用挂锁探针和连接测序。
- 基于荧光原位杂交的高通量成像：如FISSEQ、STARmap、MERFISH。
- 基于聚合酶的原位测序：类似边合成边测序（SBS）。
本文将从技术原理、方法对比、应用案例和未来展望四个维度，系统介绍原位测序技术，帮助读者理解这一前沿技术如何重塑空间生物学研究。
2. 原位测序的技术原理
原位测序的核心挑战在于：如何在组织切片这种复杂介质中实现特异性扩增和序列读取，同时保持组织形态和RNA/DNA的原位定位。所有技术共享一个基本流程：固定→透化→反转录/扩增→原位测序→成像→数据分析。
2.1 基于连接法的原位测序（ISS）
原理：ISS由瑞典科学家Mats Nilsson团队开发（2006年），使用挂锁探针（padlock probe）和滚环扩增（RCA）实现单分子检测。
步骤：
- 探针杂交：设计一个线性挂锁探针，其两端与靶序列相邻区域互补。当两端同时与靶序列结合后，在连接酶作用下环化。
- 滚环扩增（RCA）：以环状探针为模板，通过phi29聚合酶进行滚环扩增，产生包含数百个重复序列的DNA纳米球（RCP），信号放大。
- 连接测序：在RCP上，通过荧光标记的寡核苷酸与测序引物杂交，并进行连接反应（类似SOLiD测序），每轮检测一个碱基。通过多轮连接，读取序列。
- 成像：每轮荧光成像后，剥离荧光探针，进行下一轮。
优点：单分子分辨率，可检测单核苷酸变异；扩增信号强。
局限：通量较低（一次只能检测几个基因），需要预知靶序列。
2.2 基于荧光原位杂交的高通量原位测序
2.2.1 FISSEQ（荧光原位测序）
FISSEQ由Church实验室在2014年发表，是第一个真正实现全转录组原位测序的技术。
步骤：
- 固定与透化：组织经甲醛固定，细胞膜透化。
- 反转录与环化：使用随机引物进行原位反转录合成cDNA，然后利用连接酶将cDNA环化。
- 滚环扩增：phi29聚合酶扩增环状cDNA，形成RCP。
- 边合成边测序（SBS）：通过添加荧光标记的可逆终止子核苷酸，在显微镜下进行多轮测序（类似Illumina），读取cDNA序列。
- 图像分析：将每轮荧光图像配准，解析每个RCP的碱基序列，并根据RCP的二维坐标重建空间转录组图谱。
优点：全转录组，无需预知序列；单细胞分辨率。
局限：扩增效率不均，背景荧光高，测序读长短（通常20-30 bp），基因鉴定依赖于短read比对。
2.2.2 STARmap（空间分辨转录本扩增子测序映射）
STARmap由Deisseroth实验室于2018年发表，结合了挂锁探针、滚环扩增和原位测序，提高了特异性和信号强度。
改进：
- 使用特异性挂锁探针（而非随机引物），靶向数百至数千个基因。
- 引入“SNAIL”探针，提高连接效率。
- 采用“顺序杂交”测序策略，降低错误率。
优点：灵敏度高，背景低；适合中等通量（100-1000基因）的靶向空间转录组。
2.2.3 MERFISH（多重抗错荧光原位杂交）
虽然MERFISH不是严格意义上的“测序”，但其多轮杂交读取二进制编码的原理与测序类似，通常被归入原位测序范畴。MERFISH通过组合编码和顺序杂交，可在单细胞中检测数千个基因，且具有错误校正能力。
2.3 基于聚合酶的原位测序（SBS）
近年来，少数实验室开发了直接在组织切片上进行聚合酶延伸反应读取序列的方法，类似Illumina的边合成边测序，但需要在原位实现可逆终止和去保护。技术难度极高，尚未商业化。
3. 主流技术对比
| 技术 | 原理 | 通量（基因数） | 分辨率 | 优点 | 局限 |
|---|---|---|---|---|---|
| ISS（连接法） | 挂锁探针+连接测序 | 1-10 | 单分子 | 单碱基分辨率，可检测突变 | 通量低，需预知序列 |
| FISSEQ | 随机引物+RCA+SBS | 全转录组 | 单细胞 | 无偏检测，发现新转录本 | 短读长，背景高 |
| STARmap | 靶向挂锁探针+RCA | 100-1000 | 单细胞 | 高灵敏度，低背景 | 需预知靶序列 |
| MERFISH | 组合编码+顺序FISH | 1000+ | 单细胞 | 高通量，错误校正 | 仅检测预设基因，非测序 |
4. 原位测序数据分析流程
4.1 图像预处理
- 配准：多轮荧光图像间存在漂移，需使用刚性或弹性配准（基于细胞核染色或荧光标记），将不同轮次图像对齐到同一坐标系。
- 背景扣除：去除自发荧光、抗体非特异性结合等背景噪声。
4.2 细胞分割与信号识别
- 细胞核染色：使用DAPI或核标记物识别细胞核位置。
- 细胞边界分割：利用细胞膜标记或基于深度学习的语义分割（如Cellpose）划定细胞轮廓。
- RCP/荧光点检测：识别每个细胞内的荧光点，记录其坐标和强度。
4.3 碱基解码与序列读取
- 每轮碱基识别：根据荧光通道强度，判断该轮读取的碱基（如Cy3=G，Cy5=A等）。
- 错误校正：利用编码的纠错机制（如MERFISH的汉明距离）修正错误。
- 序列组装：对于FISSEQ，将短读段比对到参考转录组，分配基因身份；对于MERFISH/STARmap，直接解码出基因ID。
4.4 空间转录组可视化
- 生成基因表达的空间热图。
- 计算每个细胞（或每个像素）的基因表达谱。
- 进行降维（PCA、UMAP）和聚类，识别空间细胞类型。
4.5 下游分析
- 空间差异表达：识别组织不同区域的标记基因。
- 细胞类型空间分布：构建细胞图谱。
- 细胞间相互作用：基于空间邻近性推断配体-受体互作。
5. 应用案例
5.1 神经科学：小鼠视觉皮层细胞分型
背景：大脑皮层包含数十种不同类型的神经元，其空间分布与功能相关。
方法：MERFISH检测小鼠视觉皮层中1000多个基因，单细胞分辨率。
结果：识别出超过30种神经元亚型，每种亚型具有独特的层状分布（如L2/3、L4、L5、L6）。兴奋性神经元与抑制性神经元空间模式互补。发现了一种新的中间神经元亚型（表达Ndnf和Cxcl14）。
价值：构建了高分辨率皮层细胞空间图谱，为神经回路研究提供基础。
5.2 发育生物学：人类胚胎心脏发育
背景：心脏发育涉及复杂的细胞分化和形态发生。
方法：STARmap检测人类胚胎心脏（8周）中约200个关键基因。
结果：识别出心肌细胞、心内膜细胞、成纤维细胞等空间分布。发现心室小梁形成区域高表达Notch信号相关基因。构建了心脏发育的三维空间基因表达图谱。
价值：揭示了心脏发育的空间调控机制。
5.3 肿瘤微环境：乳腺癌免疫浸润
背景：肿瘤微环境中免疫细胞的空间分布与免疫治疗响应相关。
方法：FISSEQ对乳腺癌组织进行全转录组原位测序。
结果：鉴定出肿瘤核心区、侵袭前沿、基质区的差异表达基因。发现CD8+ T细胞在肿瘤边缘聚集（免疫排斥），而Treg细胞散在分布。空间配体-受体分析揭示PD-L1/PD-1信号主要发生在肿瘤边缘。
价值：为评估免疫治疗靶点提供了空间证据。
5.4 临床病理：原位检测EGFR突变
背景：非小细胞肺癌中EGFR突变状态指导靶向治疗，但活检样本中肿瘤细胞比例低，常规测序可能漏检。
方法：使用ISS技术设计靶向EGFR L858R和T790M突变的挂锁探针，在组织切片上原位检测突变。
结果：在低至5%的突变等位基因频率下仍可检测，且能定位突变细胞的空间分布。验证了异质性突变的存在。
价值：为临床突变检测提供了新工具。
6. 原位测序 vs 空间转录组 vs 单细胞测序
| 维度 | 原位测序 | 空间转录组（Visium） | 单细胞测序 |
|---|---|---|---|
| 空间分辨率 | 单细胞/亚细胞 | 多细胞（55 μm） | 无（解离） |
| 基因通量 | 全转录组（FISSEQ）或靶向（MERFISH） | 全转录组 | 全转录组 |
| 组织形态保留 | 是 | 是 | 否 |
| 样本通量 | 低（每张切片） | 中 | 高 |
| 技术复杂度 | 极高 | 中 | 中 |
| 适用场景 | 精细空间图谱、稀有细胞定位 | 区域表达谱 | 细胞分型、稀有细胞发现 |
三者互补：单细胞测序用于细胞类型发现；空间转录组用于区域表达谱；原位测序用于高精度空间定位和验证。
7. 挑战与未来展望
7.1 当前挑战
- 通量限制：大多数原位测序技术一次只能检测数百至数千个基因（除FISSEQ外），远低于全转录组。
- 背景噪声：组织自发荧光、探针非特异性结合导致信噪比低。
- 数据量巨大：一张切片的多轮成像产生TB级数据，存储和处理困难。
- RNA降解：组织固定和透化过程中RNA易降解，影响灵敏度。
- 细胞分割：在细胞密集区域准确分割细胞边界仍具挑战。
- 成本高昂：试剂和成像设备昂贵，限制了普及。
7.2 未来趋势
- 多组学原位测序：同时检测DNA突变、RNA表达和蛋白标记（如通过荧光抗体），实现原位多组学。
- 超分辨成像：结合STED、MINFLUX等技术，将分辨率提升至纳米级，观察亚细胞RNA定位。
- 人工智能图像分析：深度学习用于自动细胞分割、信号识别、图像配准，大幅提升分析效率。
- 原位测序与空间蛋白质组整合：同一张切片进行原位测序和CODEX/mIHC，关联基因与蛋白表达。
- 临床转化：开发自动化、标准化原位测序设备，用于病理诊断（如肿瘤突变检测、病原体鉴定）。
- 活细胞原位测序：未来可能在活细胞中动态监测RNA转录和定位。
8. 结语
原位测序技术将测序反应“搬回”组织切片，实现了空间位置与分子序列的直接关联，是空间生物学的重要里程碑。从ISS到FISSEQ，从STARmap到MERFISH，这些技术不断突破通量、分辨率和灵敏度的限制，在神经科学、发育生物学、肿瘤研究和临床诊断中展现出巨大潜力。尽管面临通量、成本和数据分析的挑战，随着成像技术、微流控和人工智能的进步，原位测序有望成为未来组织病理学和空间多组学的常规工具，推动我们从“看形态”到“读分子”的转变。
参考文献：
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