卡梅德生物技术快报｜酵母双杂交：cDNA 文库构建与互作蛋白筛选全流程技术解析
【技术干货】本文以植物病原效应蛋白筛选为案例，详细讲解酵母双杂交的实验设计、操作要点、质控标准，适合生物研发、实验室技术人员直接参考使用。
一、技术概述
酵母双杂交是体内检测蛋白 - 蛋白互作的常用技术，无需蛋白纯化，可直接从 cDNA 文库中高通量筛选未知互作蛋白，在植物 - 微生物互作、信号通路研究中应用广泛。针对核蛋白与膜蛋白的不同特性，可分别构建核系统（GAL4）与膜系统（split-ubiquitin）文库，提升筛选覆盖度。
二、实验材料与体系
- 植物材料：西瓜食酸菌侵染的本氏烟叶片
- 酵母菌株：AH109（核系统）、NMY51（膜系统）
- 载体：pGBKT7、pBT3-N（诱饵载体）；pGADT7、pPR3-N（文库载体）
- 核心方法：SMART cDNA 合成、酵母 PEG/LiAc 转化、缺陷型培养基筛选
三、核心实验流程（聚焦酵母双杂交）
1. cDNA 文库构建
选取侵染后 7、8、9 天的本氏烟叶片混合取样，提取总 RNA 并纯化 mRNA。以 mRNA 为模板，采用 SMART 技术合成双链 cDNA，经 Sfi I 酶切后与载体连接，构建初级文库，扩增后获得次级文库。质控标准：核系统库容 5.4×10⁶ CFU、重组率 98%；膜系统库容 6.0×10⁶ CFU、重组率 100%；插入片段平均长度 > 1000 bp。
2. 诱饵载体构建与验证
克隆 AopW 基因（1458 bp），通过同源重组构建诱饵载体。
- 自激活检测：BD-AopW + 空 AD 共转酵母，在三缺、四缺培养基上不生长，判定为无自激活。
- 毒性检测：诱饵载体转化后酵母生长曲线与空载组无显著差异，判定为无毒性。
3. 酵母双杂交筛选与验证
将诱饵载体与 cDNA 文库共转酵母，涂布 SD/-Trp-Leu 培养基，30℃培养 3–5 天。挑取单菌落依次点种三缺、四缺 + X-α-Gal 培养基，以生长 + 显色作为阳性判定标准。提取阳性克隆质粒测序，BLAST 比对得到互作蛋白 NbTIM22-2。通过一对一回转验证，确认 AopW 与 NbTIM22-2 在酵母体内存在特异性互作。
四、技术要点与避坑
- 样本需覆盖不同发病阶段，保证低丰度转录本不丢失。
- 文库构建必须去除短片段，提高有效库容。
- 诱饵载体未完成验证严禁筛库，避免大量假阳性。
- 膜蛋白互作优先选择膜系统酵母双杂交，传统核系统易出现假阴性。
五、总结
酵母双杂交技术流程成熟、结果可靠，是筛选蛋白互作的核心工具。本研究建立的双文库筛选体系，可直接应用于植物病原效应蛋白、抗逆蛋白、调控因子的互作筛选，为农业生物研发提供稳定技术支撑。
参考文献：柳雨欣，殷铭硕，马博雅，刘君。西瓜食酸菌侵染本氏烟酵母双杂交 cDNA 文库构建及 T3E_AopW 互作蛋白的筛选与验证 [J/OL]. 新疆农业科学，2026.