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爱了 | 这篇单细胞多组学文章，全部代码，以及16G处理后的数据，都分享了，非常好复现，照着做就行

news 2026/4/14 10:44:35

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在多数实体瘤里，Treg 细胞常被看作帮助肿瘤逃避免疫监视的角色。
但在结直肠癌中，Treg 浸润有时反而和更好的临床结局相关。
这背后究竟是同一种细胞在不同环境下“变脸”，还是本来就存在功能不同的 Treg 亚群？

2026 年 1 月 13 日，这篇工作发表于Immunity，由 Memorial Sloan Kettering Cancer Center 等团队完成。研究者结合小鼠 MSS 结直肠癌模型与人 CRC 样本发现，肿瘤内 IL-10+ Treg 和 IL-10− Treg 并非同向作用，而是分别限制和促进肿瘤进展。今天我们就来拆解一下这篇生信文章Opposing functions of distinct regulatory T cell subsets in colorectal cancer。

研究概述

这项研究聚焦一个长期存在的矛盾现象：多数癌种里 Treg 富集常提示差预后，但结直肠癌尤其是 MSS CRC 并不完全符合这一规律。作者提出，问题可能不在于 Treg 多或少，而在于肿瘤里到底是哪一类 Treg 占优势。

为此，研究团队在小鼠 AKP 正位结肠癌模型和人 CRC 手术样本中，对肿瘤浸润 T 细胞进行了单细胞转录组和染色质开放性分析。结果显示，肿瘤中存在两类可区分的 Treg 亚群：一类表达 IL10、RORC，另一类表达 IKZF2 等程序。前者主要抑制促肿瘤的 IL-17 反应，后者则更偏向压制抗肿瘤免疫，二者共同解释了 CRC 中 Treg 作用的双面性。

实验设计

研究首先采用带有Apc、Trp53缺失和KrasG12D激活的 AKP 类器官，建立小鼠盲肠壁正位移植的 MSS CRC 模型，并与 MC38 模型比较其免疫微环境和对 PD-1 阻断的反应。

随后，作者对肿瘤与邻近正常结肠组织中的 T 细胞实施配对单细胞 RNA/ATAC 多组学测序，并在 2、4、6 周多个时间点开展 scRNA-seq 动态追踪。针对功能验证，研究使用遗传学策略分别清除 IL-10+ Treg 或 IL-10− Treg，并结合 IL-10Rα 阻断、IL-17RA 缺失类器官、体外细胞因子刺激、肝转移模型以及人 CRC 多组学和空间转录组数据进行交叉验证。临床层面，作者还对 102 例 CRC bulk RNA-seq 队列进行去卷积，并分析不同 Treg 亚群与生存结局的关系。

研究结果

图 1AKP 正位类器官模型在组织学、免疫浸润特征和抗 PD-1 不敏感性方面更接近人类 MSS 结直肠癌。

图 2小鼠肿瘤与邻近结肠的单细胞 RNA/ATAC 分析显示，Treg 可分为 IL-10+ 与 IL-10− 两群，其中 IL-10− Treg 在肿瘤中逐渐富集。

图 3两类 Treg 具有不同的转录和染色质调控程序：IL-10+ Treg 偏向Il10、Maf、Zeb2等模块，IL-10− Treg 偏向Ikzf2、Il1rl1、Gata3等模块。

图 4选择性去除 IL-10+ Treg 会使肿瘤增大，而去除 IL-10− Treg 则导致明显肿瘤回缩，说明两类 Treg 对 CRC 生长的作用方向相反。

图 5IL-10+ Treg 主要通过限制 CD4+ T 细胞产生 IL-17 来抑制肿瘤，而 IL-10− Treg 更倾向于压制 CD8+ 和 Th2 相关抗肿瘤反应；IL-17 还能直接促进肿瘤类器官生长。

图 6在人 CRC 中同样可以识别 IL-10+ 与 IL-10− 两类 Treg，前者富集于邻近正常组织、关联更好生存，后者富集于肿瘤区域、关联更差生存。

图 7在肝转移灶中，Treg 构成进一步偏向 IL-10− 亚群，整体去除 Treg 可降低转移负荷，提示不同部位的 Treg 组成会影响其净效应。

数据分析

生信分析

1. 单细胞转录组

文中对小鼠原发瘤、邻近正常结肠、不同时间点样本以及肝转移相关样本进行了 scRNA-seq 分析，也对人 CRC 肿瘤与邻近正常组织 T 细胞进行了单细胞转录组分析。原始 FASTQ 先用Cell Ranger比对和计数，再按不同数据集设置线粒体比例、检测基因数、UMI 数等质控阈值。之后使用 PCA、UMAP 和 Leiden 聚类进行降维与聚类，并通过迭代子聚类进一步细分 T 细胞状态。

在表达层面，作者据此识别出小鼠肿瘤中的 Th1、Th17、Tfh、记忆 T 细胞、IL-10+ Treg、IL-10− Treg 等群体，并做时间序列变化分析。针对 IL-10+ Treg 清除后的 CD4+ T 细胞变化，还进行了 pseudo-bulk RNA-seq 差异表达分析。肝转移部分则比较了原发灶、引流淋巴结和肝转移灶中的 T 细胞构成。

2. 单细胞染色质开放性组

研究在小鼠和人 CRC T 细胞中实施了配对的 scATAC-seq 分析。ATAC 数据按片段数和 TSS enrichment 进行过滤，小鼠常用阈值包括至少 180 个 fragments 和 TSS enrichment 至少 3，人样本则至少 1,000 个 fragments 和 TSS enrichment 至少 4。

在分析上，作者对 scATAC 数据进行 tile-level 降维，小鼠使用 iterative LSI，人样本先做批次校正后再生成潜在空间嵌入。随后利用chromVAR评估不同 T 细胞群和 Treg 亚群的转录因子 motif 富集情况，发现 IL-10+ Treg 更偏向 RORC 相关程序，而 IL-10− Treg 更偏向 GATA、NR4A 等程序。

3. 多组学联合分析

这篇文章的核心分析框架是配对单细胞 RNA/ATAC 多组学。作者将同一样本的 RNA 与 ATAC 信息联用，在同一细胞尺度上同时定义细胞身份和调控状态，并把 RNA 侧的细胞标签转移到 ATAC 侧做开放染色质解释。

在调控元件推断方面，研究使用SCARlink对小鼠 CD4+ T 细胞多组学数据进行分析，在 4,315 个高变基因范围内预测基因相关增强子，并用 z-score 和 FDR 过滤候选增强子。该分析表明，Il10与Ikzf2等关键位点在两类 Treg 中具有不同的增强子连接模式，支持其为稳定而非短暂的转录状态。

4. 基因模块与空间转录组

作者用Hotspot在小鼠和人 Treg 数据中分别识别基因共表达模块，构建 IL-10+ Treg 和 IL-10− Treg 的 signature，并用scanpy的score_genes()进行模块打分。这些 signature 随后被用于跨物种比较，验证人鼠 Treg 亚群的一致性。

在人样本层面，文章还结合 10x Genomics 的 single-cell Flex 与 Visium HD 数据进行空间分析。Flex 数据先做常规 QC、归一化、PCA 和 Leiden 聚类，Visium HD 则在 8 μm 分辨率下分析，并用TACCO结合匹配的 Flex 样本做标签转移，从而推断 IL-10+ Treg 在邻近正常组织更丰富，而 IL-10− Treg 更集中在肿瘤区域。

5. 去卷积与生存分析

为了评估临床意义，作者使用来自 102 例手术样本的 bulk RNA-seq 数据，结合 10x Genomics CRC 单细胞参考图谱，通过BayesPrism估计两类 Treg 的相对丰度。随后按高低丰度分组，绘制 Kaplan-Meier 生存曲线。

此外，肝转移与原发灶之间的细胞邻域丰度变化使用Milo完成，基于 kNN 图进行 differential neighborhood abundance analysis，以比较不同组织部位中免疫细胞群体的富集差异。

统计分析

文中实验数据主要以均值 ± SEM 展示。流式、肿瘤负荷和部分功能实验根据图注分别使用非配对 t 检验、单因素 ANOVA 或双因素 ANOVA。

测序数据分析中，基因模块得分比较使用 Wilcoxon rank-sum test；差异表达火山图和细胞频率分析采用非配对 t 检验并结合 Benjamini-Hochberg 方法进行多重校正；生存分析采用 Kaplan-Meier 检验。部分图注明确标注了具体统计方法，如图 5 的多个面板分别使用非配对 t 检验、单因素 ANOVA 和双因素 ANOVA。

总结

研究意义

这篇文章回答了一个很关键的问题：为什么结直肠癌中的 Treg 浸润并不总是意味着更差结局。作者给出的解释不是“CRC 中 Treg 例外”，而是“CRC 中存在功能相反的 Treg 亚群”。

其中，IL-10+ Treg 通过抑制 Th17/IL-17 轴限制原发肿瘤生长；IL-10− Treg 则更符合传统认知，主要抑制抗肿瘤免疫并促进肿瘤进展。这个框架把小鼠遗传学、人类单细胞多组学、空间转录组和生存数据串了起来，也提示 CRC 免疫治疗未必应该简单地“整体去 Treg”，而更可能需要选择性打击促肿瘤的那一支。

作者进一步指出，CCR8 在 IL-10− Treg 上表达较高，因此这类策略或许有机会保留 IL-10+ Treg 的保护作用，同时解除 IL-10− Treg 对效应免疫的抑制。对于 MSS CRC 这类对现有免疫检查点抑制疗法反应有限的肿瘤，这一思路具有明确的转化意义。

文章复现

原始数据提供情况：

• GEO：GSE290623
• 10x Genomics 人 CRC single-cell Flex 与 Visium HD 数据集：https://www.10xgenomics.com/platforms/visium/product-family/dataset-human-crc
• Pan-cancer CD4+ T cell atlas：https://singlecell.mdanderson.org/TCM/

代码提供情况：