免疫细胞治疗体外培养指南：hPL实现T细胞高效扩增与TCM表型维持的双重保障
本文摘要
本文聚焦CAR-T、TCR-T等免疫细胞治疗的核心研发痛点——T细胞体外扩增与中央记忆T细胞（TCM）表型维持的平衡需求，基于多供体、多培养体系的实验数据，系统解析了人血小板裂解液（hPL）作为培养基补充剂，在T细胞体外培养中的核心性能表现。文中对比了hPL（nLiven PR）与人AB血清（ABS）对T细胞扩增效率、TCM亚群比例、供体间批次稳定性的影响，证实hPL可在实现T细胞高效扩增的同时，显著提升并维持TCM细胞亚群比例，降低不同供体来源起始材料的批次差异，为临床级免疫细胞制品的制备提供了合规、高效的培养基补充剂解决方案，为细胞治疗产品的工艺优化提供实验依据。
一、引言
1.1 TCM细胞是免疫治疗长期疗效的核心决定因素
以CAR-T、TCR-T为代表的T细胞疗法，已成为血液肿瘤治疗的突破性技术。传统细胞治疗的给药剂量，通常以特定表面抗原阳性的细胞总数为计算依据，期望部分细胞在回输患者后能产生持久的效应反应。
而近年来的多项研究证实，呈现中央记忆表型的T细胞（TCM），在多种疾病模型中可显著提升免疫治疗的疗效，是决定治疗长期效果的关键细胞亚群。
TCM是中央记忆型T细胞（Central Memory T cell）的简称，由初始T细胞（Naive T Cell）经抗原激活后分化而来，具备长期记忆性，可归巢至淋巴结接受抗原再刺激。当再次接触相同抗原时，TCM可快速增殖分化为大量效应记忆T细胞，发挥抗肿瘤作用。凭借归巢性、记忆性、体内持久性与强效扩增能力，TCM不仅具备肿瘤治疗作用，还兼具预防肿瘤复发的潜力，是免疫细胞治疗制品中极具价值的核心细胞群体。
图1.中央记忆T细胞TCM的分化由来
1.2 免疫细胞培养传统血清补充剂的应用局限
免疫细胞体外培养体系中，培养基补充剂的稳定供应与性能表现，是生物医药企业核心关注的问题。而传统常用的血清补充剂，在临床级细胞治疗应用中存在显著局限：
- 胎牛血清（FBS）：作为动物源试剂，在细胞治疗产品的监管申报中存在重大合规风险，同时存在批次差异大、异种蛋白免疫原性等问题；
- 人AB血清（ABS）：作为FBS的替代方案，是T细胞制造中常用的蛋白、激素与细胞因子补充来源，但其原材料受供体选择限制，供应稳定性不足；同时，其能否在维持T细胞关键表型的前提下实现高效扩增，行业内仍存在较大争议。
1.3 人血小板裂解液（hPL）的技术优势
人血小板裂解液（Human Platelet Lysate, hPL）是FBS、人AB血清的理想替代培养基补充剂，由人血小板经裂解后获得，含有丰富的生长因子、趋化因子、黏附分子等多种生物活性成分，可完美支持各类细胞的体外培养。
日立先进治疗方案公司(HCATS)与美国Sexton生物技术公司合作，开展了系统性对比实验，评估了病原体去除工艺的hPL产品nLiven PR与人AB血清（ABS），对T细胞记忆表型维持与扩增性能的影响，为免疫细胞治疗企业优化细胞培养工艺、提升终产品质量提供了完整的实验数据支撑。
图2. 血小板裂解液hPL组成成分
二、核心实验设计与结果验证
2.1 实验设计概述
本次研究通过多供体、多培养体系的平行实验，系统对比了nLiven PR（hPL）与人AB血清（ABS）作为培养基补充剂，在T细胞体外培养中的性能差异，核心实验分为三个模块：
- 静态培养体系中，hPL与ABS对PBMCs总扩增、T细胞亚群富集的影响；
- 静态培养体系中，hPL与ABS对TCM细胞亚群维持能力的对比；
- 搅拌式生物反应器放大培养体系中，hPL与ABS对不同供体来源细胞扩增一致性的影响。
2.2 实验1：hPL显著提升T细胞体外扩增效率与CD3+细胞富集
2.2.1 实验方案
从两名健康供体获取外周血单个核细胞（PBMCs），经CD3/CD28 T细胞激活剂激活后，分别添加5% nLiven PR与5% ABS作为培养基补充剂，在静态培养瓶中培养14天，动态监测细胞扩增数量，并通过流式细胞术（FACS）分析CD3+ T细胞亚群比例。
2.2.2 核心实验结果
- 总细胞扩增效率：培养第8天时，两组总PBMCs细胞数无显著差异；但培养至第10天时，nLiven PR组在两名供体的样本中，均展现出显著高于ABS组的细胞扩增效果；
- T细胞亚群富集：培养第8天的FACS分析结果显示，nLiven PR组的CD3+细胞亚群比例，供体1组达到98.2% ± 0.24%，供体2组达到97.6± 0.26%；而ABS组的CD3+细胞亚群比例，供体1组为94.8%±0.63%，供体2组为91.9%±1.47%；
- 结论：nLiven PR对PBMCs总扩增的促进作用，核心源于其对T细胞亚群的特异性扩增与富集，可更高效地获得高纯度的CD3+ T细胞。
图3.两名捐赠者的 PBMCs 在以 ABS 和 hPL 作为培养补充剂的扩增对比
2.3 实验2：hPL可在扩增同时显著维持并提升TCM细胞亚群比例
TCM细胞亚群的占比，是免疫细胞治疗制剂临床疗效的关键参考指标，相比总T细胞产量，终产品中的TCM亚群数量更具治疗相关性。本次实验系统评估了两种补充剂对TCM表型维持的影响。
2.3.1 实验方案
- 采用6名独立供体的PBMCs，分别在5% nLiven PR与5% ABS体系中静态培养14天，检测培养前后TCM细胞亚群的比例变化；
- 额外选取3名供体的CD3+阳性T细胞，在相同体系中完成培养周期，对比TCM亚群的变化差异。
2.3.2 核心实验结果
- PBMCs培养体系：常规认知中，TCM细胞亚群的百分比通常与细胞群体翻倍次数呈负相关，ABS培养组完全符合这一趋势——PBMCs扩增的同时，TCM细胞群体显著减少；而nLiven PR培养组，在细胞总产量与ABS组相近的情况下，TCM亚群比例实现了统计学上的显著提升，14天培养周期结束后，约30%的T细胞群体为TCM表型，且该结果与供体初始PBMCs中TCM的起始比例无关；
- 纯化CD3+ T细胞培养体系：以纯化CD3+ T细胞为起始材料的实验中，培养结束时nLiven PR组约50%的T细胞亚群为TCM表型，与ABS组相比，3名供体的TCM细胞亚群均出现统计学意义的显著增加；
- 结论：nLiven PR可打破“T细胞扩增伴随TCM表型丢失”的常规规律，在体外培养全过程中选择性地促进TCM表型的维持，在实现T细胞高效扩增的同时，获得更高比例、更高质量的TCM细胞。
图4.三个供体的CD3+阳性的细胞用hPL和AB血清扩增后TCM的比例
2.4 实验3：hPL显著降低不同供体间的细胞扩增批次差异
不同供体来源的起始材料带来的批次差异，是细胞治疗制品开发与商业化生产中的核心难点，本次实验在放大的搅拌式生物反应器体系中，评估了两种补充剂对供体间差异的影响。
2.4.1 实验方案
选取3名供体的CD3+ T细胞为起始材料，经Dynabeads CD3/CD28激活剂处理后，分别在添加nLiven PR与ABS的培养基中，于搅拌式生物反应器内培养11天，监测细胞扩增倍数，并分析不同供体间的结果变异系数。
2.4.2 核心实验结果
- 总扩增效率：nLiven PR组与ABS组的平均细胞群体翻倍次数无统计学显著差异，分别为6.1±0.58与6.0±1.37，二者均可支持T细胞在生物反应器中的规模化扩增；
- 供体间批次稳定性：nLiven PR组3名供体的扩增结果变异系数仅为10%，而ABS组的变异系数高达23%，nLiven PR可显著降低不同供体间的结果差异；
- 结论：nLiven PR作为培养基补充剂，可有效缓解供体间个体差异带来的细胞培养结果波动，降低起始材料的可变性，帮助开发者获得批次更稳定、特征更均一的治疗用细胞。
三、补充验证与研究结论
3.1 补充研究验证
美国贝勒医学院的Norihiro Watanabe团队，同步开展了平行对比实验，评估了FBS、ABS与Sexton公司的hPL产品T-Liven PR作为培养基补充剂，对CAR-T细胞记忆表型与体内治疗疗效的影响。
实验结果显示：与ABS和FBS相比，T-Liven PR培养组的CAR-T细胞中，中央记忆表型TCM、初始T细胞TN的占比，以及细胞总存活率，均出现统计学上的显著提升，进一步证实了hPL在维持T细胞低分化表型、提升免疫细胞治疗产品质量上的稳定效果。
图5.相对于FBS和ABS，Sexton血小板裂解液T-Liven的扩增效率更高，更有助于T细胞维持较低的分化水平状态
3.2 核心研究结论
本次多供体、多体系的系统性实验，得出三大核心结论，完全贴合免疫细胞治疗工业化生产的核心需求：
- 扩增性能：hPL（nLiven PR）可高效支持T细胞的体外扩增，同时实现CD3+ T细胞的特异性富集，获得更高纯度的治疗用细胞；
- 表型维持：hPL可打破T细胞扩增伴随分化的常规规律，在扩增的同时显著提升并维持TCM中央记忆T细胞亚群比例，获得更高质量、更具体内长期疗效的治疗用细胞；
- 批次稳定性：hPL可显著降低不同供体来源起始材料带来的批次差异，提升细胞培养工艺的稳定性与均一性，适配免疫细胞治疗的工业化放大生产需求。
综上，将hPL应用于T细胞体外培养与细胞制品制造过程中，可在不牺牲扩增效率的前提下，显著提升治疗用T细胞的质量，为免疫细胞治疗产品的临床转化提供稳定、合规的工艺支撑。
四、FAQ 高频技术问题解答
1. 问：在免疫细胞治疗中，中央记忆T细胞（TCM）为什么如此重要？
答：TCM细胞具备三大核心优势，直接决定免疫治疗的长期疗效：一是长期记忆性，可在体内长期存活，应对肿瘤抗原的再次刺激；二是强效扩增能力，接触抗原后可快速分化为大量效应T细胞，发挥抗肿瘤作用；三是归巢性，可归巢至淋巴结接受抗原刺激，持续发挥作用。已有研究证实，TCM细胞相比效应T细胞，能赋予更优异的体内抗肿瘤免疫效果，同时具备预防肿瘤复发的潜力。
2. 问：人血小板裂解液（hPL）相比人AB血清（ABS），在T细胞培养中的核心优势是什么？
答：核心优势主要有三点：一是可在实现T细胞高效扩增的同时，显著提升并维持TCM中央记忆细胞亚群比例，而ABS会伴随细胞扩增出现TCM亚群显著减少；二是可显著降低不同供体来源细胞的培养结果差异，变异系数从ABS组的23%降至10%，提升批次稳定性；三是原材料供应更稳定，生产工艺可实现多供体混合的均一化制备，规避了ABS供体选择受限的问题。
3. 问：实验中hPL对TCM表型的维持效果具体如何？
答：实验数据显示，以PBMCs为起始材料培养14天后，hPL组约30%的T细胞为TCM表型，而ABS组TCM亚群随细胞扩增显著减少；以纯化CD3+ T细胞为起始材料时，hPL组培养结束后约50%的T细胞为TCM表型，且在6名独立供体、3名纯化CD3+细胞供体的实验中，均实现了TCM亚群统计学意义的显著提升，结果稳定可重复。
4. 问：hPL为什么能降低不同供体间的细胞培养批次差异？
答：核心原因在于生产工艺的差异。hPL在生产过程中，会采用多供体血小板混合、均一化的裂解与制备工艺，最终产品的生物活性成分、生化指标高度均一；而人AB血清多为单供体或少量供体混合，不同批次间的成分差异显著。这种产品本身的均一性差异，最终带来了细胞培养结果的供体间差异降低。
5. 问：nLiven PR在搅拌式生物反应器的放大培养中表现如何？
答：在11天的搅拌式生物反应器培养中，nLiven PR组的平均细胞群体翻倍次数达到6.1±0.58，与ABS组无统计学显著差异，完全可支持T细胞的规模化放大培养；同时，nLiven PR组不同供体间的扩增结果变异系数仅为10%，远低于ABS组的23%，在放大生产中展现出更优异的批次稳定性，完美适配商业化生产需求。
6. 问：hPL在CAR-T细胞培养中是否同样有效？
答：有效。美国贝勒医学院的补充实验证实，Sexton公司的T-Liven PR hPL产品，在CAR-T细胞培养中，可显著提升中央记忆表型TCM、初始T细胞TN的占比，同时提升细胞总存活率，赋予CAR-T细胞更优异的体内持久性与抗肿瘤疗效，完全适配CAR-T等基因修饰免疫细胞的培养需求。
五、参考文献
[1] Klebanoff CA, Gattinoni L, Torabi-Parizi P et al. Central memory self/tumor-reac-tive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells. PNAS 2005; 102 (27): 9571–6.
[2] Manufacturing of primed mesenchymal stromal cells for therapy. Nature Biomedical Engineering,2019. 3(2): 90-104.
[3] Torres Chavez A, McKenna MK, Canes¬trari E et al. Expanding CAR T cells in human platelet lysate renders T cells with in vivo longevity. J. ImmunoTher. Cancer 2019; 7: 330.
技术来源说明
本文内容基于HCATS与美国Sexton Biotechnology公司的官方实验数据整理。美国Sexton公司是全球领先的人血小板裂解液供应商，其旗下无动物源、无需添加肝素的hPL产品，覆盖科研级到GMP级全流程需求：经典Stemulate产品适配干细胞治疗的科研、临床与GMP生产需求；针对免疫细胞治疗的nLiven PR（病原体去除工艺临床级hPL）、T-Liven PR（封闭袋装系统PR工艺hPL）产品，均已在FDA完成药物主文件（DMF）备案，符合全球细胞治疗质量与监管要求，是临床级免疫细胞与干细胞治疗应用中FBS/ABS的高性能替代品。
上海曼博生物医药科技有限公司为Sexton Biotechnology品牌中国大陆地区官方授权供应商，专注于为细胞治疗、免疫治疗领域提供合规的GMP级细胞培养试剂与全流程技术支持，可点击咨询曼博生物供应Sexton人血小板裂解液。