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即使拥有昂贵且高性能的显微镜，若光源使用不当，往往也难以获得理想的成像效果。一个最常见的问题就是样品照明不足。经过优化的标本照明应当明亮、无眩光，并在视场内均匀分布。
显微镜的光源种类繁多，既适用于日常观察，也适用于关键的显微摄影。其中，50瓦或100瓦的卤素钨灯是上一代最常用的光源，因其成本低廉且使用寿命长而广受欢迎。如上图所示，这是显微镜底部典型的卤素钨灯；图中还详细展示了现代透射光显微镜的光学路径。在该图中，卤素钨灯发出的连续光谱以3200开尔文为中心（当灯泡电压设定为+9伏时）。光线经聚光镜和场镜后，被反射至载物台下方的聚光器，并照射到样品上。形成图像的光线由显微镜物镜汇聚，随后进入目镜，或者经分光棱镜导向至相机接口。在整个光学路径中，从光源发出的光线经过一系列光圈和透镜的定向与聚焦，最终抵达样品并进入目镜或相机附件。现代显微镜光学元件的对准工作，旨在实现最佳照明效果，需遵循柯勒照明原理。图1所示的光学路径代表了典型透射光显微镜的结构，涉及多个透镜、光圈、反射镜和分光棱镜，用以引导光线通过显微镜系统。
钨卤素灯亮度较高，其色温范围以3200开尔文为中心（在约+9伏电压下），但需使用彩色转换滤光片才能将其色温提升至与日光相当的水平。另一种颇受欢迎的光源是75至150瓦的氙气灯，因其亮度极高、使用寿命长，在可见光谱范围内输出相对均匀，且色温接近日光胶片乳剂所要求的水平。在需要极高光照强度的场合，常采用锡卤化物灯。在荧光显微镜观察中，尤其是用于关键性摄影时，通常会使用100瓦或200瓦的汞灯。过去，人们可能还会用碳弧灯或锆灯，但如今这些光源已很少见了。
在反射光显微镜中，通过光学路径对光源进行准直同样至关重要，尤其是在金相学、半导体晶圆检测以及荧光显微镜领域。反射光显微镜可采用多种光源进行照明，并可通过科勒照明方式加以调节，以实现最佳性能。
在约翰·德利所著的《显微镜下的摄影》中，他指出，提交给比赛、展览和科学出版物的显微照片中，有80%到90%都因光学元件未正确对齐而导致样品照明效果不佳。这正是显微成像乃至一般显微摄影中最常见的问题之一。如果对许多大学实验室中的学生显微镜进行一次意外检查，便会发现大量次级聚光镜和光源调节不当的现象。我们推测，对于特定显微镜而言，从低倍到高倍整个物镜范围内，次级聚光镜与视场光阑的错误对齐与调节，是造成显微摄影误差的最大根源。恰当照明的重要性怎么强调都不为过。往往，一台价值2.5万美元的显微镜，由于照明和对焦不当，其性能竟被降至与手持放大镜无异，最终拍摄出的显微照片甚至比用一台仅售2000美元、在柯勒照明最佳条件下操作的显微镜所拍的照片还要逊色。
在本入门教程中，有关柯勒照明理论及其具体实施（包括透射光和反射光两种情况）的配套章节里，我们详细探讨了显微镜配置的关键要素，并精心设计了多种互动式Java教程，以帮助学生深入掌握这些重要概念。
无焦或非聚焦照明——在光学系统中，若光源的像并未在光路中的某处形成，则这种照明方式被称为无焦或非聚焦照明。在电灯发明之前，显微镜学家们可选择的适宜光源十分有限。白天时，他们可以将显微镜（或载物台下方的反射镜）对准天空，利用云层作为粗糙的漫射屏，使光线均匀地照亮整个视场。此外，仪器制造商还研磨出凹面反射镜，以增强物镜平面的光照强度。然而，云层和蓝天本身并不是易于在显微镜光学路径中成像的光源，因此它们属于无焦照明的范畴。室内及夜间工作迫使早期的显微镜学家转而依赖人工光源。由于这些人工光源固有的色温较低，所呈现的标本颜色在亮度、色调和明暗程度上与自然日光下观察到的有所不同。为了弥补这一缺陷，显微镜学家们曾使用各种蓝色滤光片，以调整人工光源的表观色温，使其尽可能接近自然日光的色温。不过，由于这些早期的照明方法并未在光路中任何位置形成光源的像，它们仍属于无焦或非聚焦照明的范畴。
早期研究发现，当在日光与人工光源之间切换时，只要物镜的后透镜完全被光线充满，图像的光学特性或分辨率实际上并无明显变化。后来，科学家们发现，最重要的条件是照明的数值孔径至少应与物镜的数值孔径相等。19世纪，新的照明光源相继问世，并且一种全新的“光源聚焦”（后来被称为临界照明或尼尔森照明）方法也被开发出来，以进一步改善显微镜的照明条件。
临界照明（Critical Illumination）——这种显微镜照明方法最早由英国显微镜学家爱德华·尼尔森基于恩斯特·阿贝所推动的光学原理研发而成。从19世纪后半叶直至20世纪相当长的一段时期内，尼尔森式照明都得到了显微镜学家们的高度成功应用。时至今日，仍有一些倡导者坚持使用临界照明技术，尤其适用于需要外接光源的显微镜，或是价格较为低廉、无需进行摄影观察的学生显微镜。
尼尔森式照明法利用载物台下方的聚光镜，将燃烧油灯（或其他均匀光源）所发出的火焰成像于标本所在平面，从而在整个视场范围内实现较为均匀的照明效果。在采用这种照明方法时，光源的均匀性是至关重要的因素。燃烧油灯所产生的火焰相当均匀且稳定，但其他光源，如磨砂放大灯泡、乳白灯泡或带状灯丝，也可用于实现关键照明。图2展示了利用假设的油灯作为均匀光源进行关键照明时的光学路径。
油灯火焰发出的光线必须经由物镜下方的聚光镜聚焦（参见图2），以便在载玻片上的标本平面上形成火焰的成像。实际上，往往很难（甚至根本无法）在火焰的中央部位找到清晰的焦点，因此通常先对火焰的“边缘”进行聚焦，随后再微调物镜下方的反光镜，使火焰中央部位的成像充满整个视野。进入显微镜的光线强度可通过视场光阑加以控制——如果配备有视场光阑，它一般安装于显微镜外部。为使物镜后方的成像平面完全充满光线，必须确保足够的进光量，而这可通过恰当调节聚光镜的孔径光阑来实现。将光源聚焦于样品平面的操作颇具挑战性，常常会导致背景出现颗粒状、不均匀或斑点状的现象。为克服这一问题，可稍微放松物镜下方聚光镜的焦距，以获得更加均匀的背景效果。如今，尼尔森式照明已基本被效率高得多的柯勒式显微镜照明方法所取代。
科勒照明——这一主题将在本入门手册的另一章节中作更详细的讨论，但在此我们仅简要介绍其主要特点。在科勒照明中，光源的图像被聚焦于聚光镜孔径光阑处，从而通过样品或物体所在平面产生平行（但未聚焦）的光线。位于聚光镜下方、即孔径光阑处的光源放大图像，会形成一个宽阔的照明锥体，这是实现样品最佳分辨率所必需的。聚光镜孔径光阑的大小可用于控制照射样品的光锥的数值孔径，同时有效减少不必要的杂散光和眩光。此外，还能最大限度地降低聚光镜玻璃表面灰尘及其他瑕疵对成像的影响。
高效的样品照明在很大程度上取决于显微镜中所有光学元件的正确对齐，包括照明光源。资深的显微镜使用者应熟悉每个部件的调节范围，并针对不同样品和物镜反复练习对齐操作。照明不均匀会对显微照片的质量造成严重影响，导致“热点”、暗角、色彩边缘、对比度不佳以及各种其他不良现象。一些最新的显微镜配备了“预对中”灯泡，无法进行调节；甚至有些显微镜所配的聚光镜也未设侧向调节机构。因此，在进行显微摄影之前，务必确认这些显微镜已在出厂时按照正确的科勒照明方式完成对齐。请仔细阅读显微镜使用说明书，或向工厂的技术代表咨询有关这些显微镜如何优化照明的重要细节。