PJ项目文章 | ChIP-seq助力中国农业科学院茶叶研究发现促进茶树芽休眠解除的表观机制
茶树越冬芽的萌发时间直接影响春茶产量和经济价值，但其休眠释放的分子机制尚不明确。虽已知表观修饰在植物生长发育中起关键作用，但它们在茶树芽休眠释放中的精确调控机制，特别是如何整合激素信号通路，仍不清楚。
近日，中国农业科学院茶叶研究所郝心愿研究员、王新超研究员联合西南大学曾亮教授团队在期刊《The Plant Journal》发表题为“Epigenetic activation of auxin signaling: coordinated CHH hypomethylation and histone modifications promote bud dormancy release in tea plants”的研究论文。该研究利用表观多组学对茶树“龙井43”的腋芽进行发育阶段的纵向研究，发现CHH低甲基化与H3K4me3/H3K27ac组蛋白修饰协同激活生长素信号通路，从而促进细胞周期重启和细胞壁重塑，最终驱动芽萌发。爱基百客为该研究提供ChIP-seq的技术支持。
研究方法
组织学观察、RNA-seq、WGBS、ChIP-seq（H3K4me3、H3K27ac）、功能验证
研究结果
01 休眠转换过程中芽状态的分类和转录组景观
研究根据电子显微镜下的形态学和微观结构观察结果，将芽的发育状态划分为4个阶段：休眠诱导期、内生休眠期、内休眠解除期和生态休眠解除与芽萌发期。根据上述形态学观察结果，研究选取了六个不同发育阶段的腋芽进行转录组测序。PCA和DEG聚类分析表明6个不同时期的样本可以分为两组：一类为芽形成（Bud-set）和生态休眠阶段（EcoS1、EcoS2），另一类为内休眠阶段（EndoS1、EndoS2、EndoS3）。这说明不同休眠时期在基因表达水平上具有明显差异，也进一步验证了形态学分期的准确性。
图1：茶树腋芽生长停滞至萌发的精确分类。
转录组共鉴定出10,755个差异表达基因，占所有表达基因的32.05%。这表明休眠转换伴随着大规模的转录重编程。通过K-means聚类，将所有差异基因按表达模式分为5个簇（C1-C5），分别对应不同的生物学过程。
图2：茶芽从休眠建立到释放过程中的转录组景观。
02 DNA低甲基化可激活越冬芽的萌发
转录组分析发现，在茶树芽进入生态休眠时，与DNA甲基化和组蛋白修饰相关的基因显著富集，提示茶树芽休眠解除过程中可能伴随着表观遗传重编程。于是，研究对芽形成期、内休眠期和生态休眠期3个阶段的芽样品进行WGBS，构建DNA甲基化图谱。研究共检测到3种DNA甲基化类型：CG、CHG 和CHH。在休眠解除早期，三种甲基化水平整体较稳定；但到了芽萌动阶段，三类甲基化水平均明显下降，尤其是CHH甲基化下降最为显著。同时，生态休眠阶段出现了最多的低甲基化差异区域，说明DNA去甲基化可能是茶树越冬芽重新激活的重要表观遗传机制。进一步分析甲基化分布特征和差异甲基化区域，发现CHH类型拥有最多的差异甲基化区域，并且在不同阶段之间表现出明显的双向变化。这些双向变化表明，CHH甲基化在解除芽休眠期间塑造全基因组甲基化图谱的重要作用。最后，研究还分析DNA甲基转移酶、去甲基化酶和建立CHH甲基化的RdDM通路相关基因的表达水平，发现主动去甲基化增强和新甲基化建立减弱，共同推动了CHH甲基化的擦除。
图3：茶树从休眠建立到生态休眠的DNA甲基化动态变化研究。
为了明确DNA甲基化与基因表达的关系，研究将差异甲基化区域与差异表达基因进行联合分析，发现大量差异甲基化基因参与多个关键通路，包括碳水化合物和淀粉代谢、MAPK信号通路、植物激素信号转导、油菜素内酯生物合成、昼夜节律调控。转录组分析显示在生态休眠阶段，IAA、生长素相关基因、细胞分裂素、赤霉素和茉莉酸信号基因明显上调；而ABA相关基因在内休眠阶段表达更高，呈现相反趋势。这表明IAA、GA、CK和JA信号有助于促进休眠解除和芽萌动，而ABA更倾向于维持休眠状态。进一步分析发现，IAA、GA、CK和JA相关基因在内休眠阶段具有最高CHH甲基化水平，对应表达最低；而在芽萌动前，CHH甲基化显著下降，基因表达明显升高。这说明CHH甲基化对这些关键激素信号基因具有负调控作用。类似地，淀粉和蔗糖代谢相关基因在生态休眠阶段CHH甲基化下降、芽萌发前表达升高，可能促进淀粉和蔗糖分解，为芽萌动提供能量。
图4：CHH甲基化水平降低可促进茶树芽休眠解除。
03在芽萌发期间，协同的H3K4me3和 H3K27ac标记动态变化调控了细胞周期的重启与细胞壁的重塑
研究进一步关注两类与基因激活密切相关的组蛋白修饰：H3K4me3和H3K27ac。选取EndoS2和EcoS2时期样本进行ChIP-seq，分析显示H3K4me3和H3K27ac主要富集在基因转录起始位点附近。与内休眠芽相比，生态休眠阶段这两类修饰信号明显增强，说明它们可能参与重新激活休眠芽中的转录程序。研究共识别到大量与H3K4me3和H3K27ac相关的差异修饰基因。其中，H3K4me3和H3K27ac相关基因的表达水平均与修饰水平呈正相关。值得注意的是，有1954个基因同时受到H3K4me3和H3K27ac双重修饰，说明这两种激活型组蛋白标记可能协同促进基因表达。这些双重修饰基因主要富集在与芽萌动密切相关的过程，包括细胞周期调控、DNA复制与链延伸、细胞壁组织、细胞骨架组织、微管相关运动。这些过程都与芽从休眠状态重新进入活跃生长密切相关。
研究发现多类细胞壁重塑基因和细胞周期基因在EcoS2阶段被明显激活，包括PME、XTH、EXPA/EXPB、BGLU、CYCA/CYCB/CYCD。这些基因同时表现出H3K4me3/H3K27ac修饰增强和表达上调，说明两类组蛋白修饰可协同启动细胞周期重启和细胞壁松弛，为芽萌发提供结构和生长基础。进一步分析发现，在生态休眠阶段，负责添加H3K4me3的组蛋白修饰酶基因CsATX2a/2b/5，以及负责添加H3K27ac的组蛋白修饰酶CsHAC1/12、CsMIS1表达升高。相反，去除这些修饰的擦除酶基因，如CsJMJ14/15/17和CsSRT1表达下降。这种“写入增强、擦除减弱”的模式，可能解释了生态休眠阶段H3K4me3和H3K27ac全局富集的现象。
图5：动态组蛋白修饰调控芽休眠解除过程中的季节性基因表达。
04 CHH低甲基化与组蛋白修饰之间的表观遗传交互作用激活了芽萌发相关基因
甲基化DNA通过与组蛋白修饰相互作用来调节基因活性。为调查茶树中这两种机制的串扰，研究对呈现CHH低甲基化（CHH_hypo DMGs）和Up_DEGs的基因中的两种组蛋白修饰标记H3K4me3和H3K27ac进行了分析。大多数由CHH_hypo介导的Up_DEGs与同时具有两种修饰的基因存在重叠。对这些重叠基因集进行KEGG富集分析，显著富集通路包括DNA复制、蔗糖和淀粉代谢、植物激素信号转导以及黄酮和甾体等次生代谢物生物合成等通路，说明表观遗传重编程重点作用于细胞分裂、能量代谢、激素响应及生长发育相关过程。
以生长素早期响应基因CsARF18和CsIAA1为代表，研究发现其在生态休眠至萌芽阶段发生了典型的协同表观变化：启动子区域CHH甲基化水平明显下降，同时H3K4me3和H3K27ac 富集增强，而mRNA显著升高。研究还采用qRT-PCR、ChIP-qPCR、BSP验证了这一结果。综上，这些结果表明茶树休眠解除过程中CHH低甲基化、组蛋白修饰H3K4me3/H3K27ac和基因表达上调存在正相关关系。
图6：CHH甲基化与组蛋白修饰对基因表达的协同调控。
05激素信号传导的表观遗传激活促进芽萌发
为进一步探究植物激素信号通路在芽休眠与萌发表观遗传调控中的中介作用，研究对冬季芽休眠期和芽萌发期的植物激素变化进行了定量分析。在所有受表观遗传调控的激素通路中，IAA的响应最为强烈。为了验证IAA在芽休眠和芽萌发中的作用，研究监测了IAA的动态变化，结果表明IAA稳态受其合成途径和代谢途径的共同调控。直接向休眠茶枝喷施外源IAA，可显著加速芽的萌发。除IAA外，研究还探讨了ABA、GA、JA和CK在复杂休眠过程中的调控作用。总的来说，茶树越冬芽的萌发，并非单一机制驱动。CK、ABA、IAA和JA的生物合成及代谢途径可能协同调控茶树的芽萌发过程。
图7：芽休眠至破芽期间吲哚-3-乙酸（IAA）积累动态及生物合成途径基因表达。
06 抑制DNA甲基化促进了茶树的芽萌发
为验证DNA甲基化在解除休眠状态中的作用，研究对处于内生阶段的茶芽施用了三种不同浓度的DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷（5-Aza）。结果发现其（低于25μM）能显著加速休眠茶芽的萌发过程，并激活了去甲基化酶及一系列萌发相关基因的表达。
图8：5-氮杂胞苷（5-Aza）处理可促进茶树芽的萌发。
07 CsARF18促进芽体萌发，并对下游基因CsEXP10和CsCYCD3.3发挥反式激活作用
为了进一步验证关键基因CsARF18在茶树芽萌发中的功能，研究对其进行了基因沉默，结果显示茶芽的萌发时间表现出了显著的延迟。另外，双荧光素酶报告实验表明CsARF18作为一个正向转录调控因子，能够直接激活下游细胞壁重塑基因（CsEXP10）和细胞周期调控基因（CsCYCD3.3），从而驱动芽的萌发。
图9：CsARF18的功能验证及其对CsEXP10和CsCYCD3.3表达的激活作用。
总 结
研究发现了CHH低甲基化与组蛋白修饰（H3K4me3和H3K27ac）在重塑转录格局以及同步糖代谢重编程和植物激素（特别是IAA途径）信号传导中的协同作用。关键的是，在生态休眠期间，IAA并不是作为打破休眠的启动者，而是作为“重新生长的执行者”，它由信号组件（CsARF18和CsIAA7）以及细胞效应因子（CsCYCD和CsEXP）的表观遗传去抑制直接激活。本研究提供了一种超越蔷薇科/木本植物模型的常绿植物特有范式，从而扩展了休眠解除的表观遗传理论，并揭示了表观遗传与IAA的协同作用如何调节发育阶段的转变。