基因鉴定步骤及常见问题

一、基因组 DNA 提取

（一）消化鼠尾

消化液配方为溶剂水与SDS、酶。

Solution：0.5%SDS破坏细胞膜和核膜，释放DNA。

Enzyme：1 mg/ml蛋白酶K分解样本中的蛋白质，释放DNA。

（二）样品处理

1、小鼠尾巴

剪取 0.2 - 1cm 的小鼠尾尖置于上述配制好的 100μl 消化液中，确保小鼠尾巴完全浸没在溶液中。一般情况下，重量约为 15mg 的 1cm 长的小鼠尾尖刚好能浸没在含有 100μl 消化液的 PCR 管中，小鼠尾巴的重量不宜超过 15mg。

对于新鲜的小鼠尾巴，建议尽量在剪下鼠尾后 30 分钟内进行基因组 DNA 抽提，否则宜尽快冷冻存放。

2、毛发

剪除头发的多余部分，仅需保留头发的根部区域并将其置于上述配制好的 100μl 消化液中，每次提取只需一根带根部的头发。

3、唾液

吸取 10μl 的唾液加入上述配制好的 100μl 消化液中，涡旋或移液枪吹打混匀。

（三）裂解步骤

1、55℃消化

将样品置于 55℃水浴，孵育 15 分钟。

55℃孵育的主要目的是使酶在适宜的温度下发挥活性，对组织样本进行消化

2、95℃灭活

将样品置于 95℃水浴，孵育 5 分钟（孵育结束后组织未完全消化属于正常现象，不会影响检测效果）。

在55℃孵育后，酶（如蛋白酶）仍在溶液中，为了确保后续实验结果的准确性，需要通过高温处理来灭活这些酶，防止它们在后续步骤中继续对样品产生影响。

高温处理可以使DNA双链解开为单链，这有助于在后续的PCR反应中提高引物与模板DNA的结合效率，从而提高PCR扩增的效率和特异性。

（四）DNA保存

- 20℃或 4℃保存或立即进行 PCR 检测（提取物 4℃能保存至少 1 个月，- 20℃至少能保存一年）。

二、PCR 扩增

（一）PCR 反应体系的设置

Milli-Q 水 - 7.4μl

DNA模板 20ng/μl - 1μl

上下游引物混合物 0.8μM - 1.6μl

PCR Master Mix - 10μl

总体积 - 20μl

（二）PCR程序

起始变性 94℃ 3min 1

变性 94℃ 30sec 30 - 35循环

退火 55℃ 30sec 1

延伸 72℃ 10min 1

保存 4℃ forever

三、琼脂糖凝胶电泳

取PCR产物，按比例与6×Loading Buffer混合。

100 V下，1%胶分离1kb片段约需30分钟。

对比Marker判断DNA片段大小。

PCR扩增出的基因发光

四、无目的条带如何解决

延长消化时间或增加酶量 ：组织消化不够充分。可适当延长 55℃消化时间或适当增加 Enzyme Mix 的使用量。

优化引物设计 ：引物设计不佳是 PCR 过程中最常见的问题。请选择适当的引物设计软件进行引物设计，注意引物的 GC 含量、二级结构、二聚体、退火温度、长度、特异性等方面的问题。在加入酶切位点等的引物中，一定要注意加入酶切位点等后整条引物的 GC 含量、二级结构、二聚体、退火温度、长度、特异性等方面的问题。在原有引物效果不佳的情况并且阳性对照引物可以正常工作的情况下，可以考虑更换引物。

采用 Touch down 方法 ：由于引物存在一定的二级结构或存在一定的引物二聚体，或引物偏短，导致退火效果不佳。此时可以采用 Touch down 等方法进行退火，通常采用从 65℃逐步缓慢降温到 55℃或 50℃的方法，使退火更加充分。

优化退火温度 ：退火温度不佳，需要优化。如果有温度梯度 PCR 仪，则可以设置退火的温度梯度，摸索退火的最佳温度。如果没有温度梯度 PCR 仪，则可以通过多次 PCR 反应摸索最佳的退火温度。

调整延伸时间 ：延伸时间不足。可按照每 1kb 片段延伸 1 分钟进行设置，对于较难扩增的片段可以设置为每 1kb 片段延伸 1.5 - 2 分钟。

调节起始变性条件 ：待扩增片段 GC 含量较高或长度较长，变性不够充分。可以调节起始变性条件至 95℃ 1min 甚至 95℃ 2 - 4min。

增加循环数 ：循环数不足，适当延长 PCR 的循环数。通常循环数最高不必超过 40，常用的循环数范围为 25 - 35。

设置对照 ：注意设置适当的阳性对照和阴性对照通常会有很大帮助。

阳性对照是已知含有目标DNA序列的样本，用于验证PCR反应体系（引物、酶、缓冲液等）的有效性。

阴性对照是用无菌水代替模板DNA，用于检测反应体系中是否存在污染或非特异性扩增。