从10x Visium到MERFISH：用Scanpy搞定空间转录组数据预处理与可视化的完整流程

从Visium到MERFISH：基于Scanpy的空间转录组全流程实战指南

空间转录组技术正在彻底改变我们对组织微环境的理解。想象一下，你手中握有一张组织切片，不仅能看清每个细胞的形态，还能精确知道每个位置上哪些基因正在活跃表达——这正是空间转录组带给生物医学研究的革命性视角。不同于传统单细胞测序丢失空间信息的局限，这项技术保留了基因表达的空间坐标，让研究者能够绘制出组织中分子活动的"地理地图"。

对于刚接触这一领域的生物信息分析师来说，最大的挑战往往不是理论理解，而是如何快速上手处理这些特殊的数据。本文将带你使用Python生态中最强大的单细胞分析工具Scanpy，逐步解析10x Visium和MERFISH两种主流空间转录组数据的处理全流程。无论你是准备分析自己的实验数据，还是想要复现文献中的精彩发现，这篇实战指南都将成为你实验室工作台上的必备参考手册。

1. 实验设计与数据准备

空间转录组实验的成功始于明智的技术选择。目前主流平台可分为两大类：基于测序的Visium技术和基于成像的MERFISH方法。Visium通过特殊设计的载玻片捕获mRNA，每个spot直径55微米，通常包含1-10个细胞；而MERFISH通过多重荧光原位杂交实现单分子分辨率，能精确定位到亚细胞水平。

数据获取途径对比：

对于Visium数据，Scanpy提供了便捷的接口直接获取公开数据集。例如获取人类淋巴结数据：

import scanpy as sc adata = sc.datasets.visium_sge(sample_id="V1_Human_Lymph_Node") adata.var_names_make_unique()

MERFISH数据通常需要从研究论文的补充材料中手动下载。以2019年Xia等人的小鼠下丘脑数据为例：

import pandas as pd coordinates = pd.read_excel("pnas.1912459116.sd15.xlsx", index_col=0) counts = sc.read_csv("pnas.1912459116.sd12.csv").transpose() adata_merfish = counts[coordinates.index, :] adata_merfish.obsm["spatial"] = coordinates.to_numpy()

提示：处理MERFISH数据时需特别注意坐标系的统一，某些数据集可能使用微米为单位，而另一些使用像素坐标。

2. 数据质控与预处理实战

空间转录组数据的质量控制需要兼顾分子生物学特征和空间特性。与传统单细胞分析不同，我们不仅要关注细胞层面的质控指标，还需要考虑空间位置上的异常模式。

关键质控指标解析：

• 线粒体基因比例：高于20%可能提示细胞应激或死亡
• 总UMI计数：Visium数据通常在5,000-35,000之间
• 检测基因数：健康组织一般在1,000-4,000个基因
• 空间离群点：检查边缘或孤立区域的高表达点

计算质控指标的实用代码：

# 标记线粒体基因 adata.var["mt"] = adata.var_names.str.startswith("MT-") sc.pp.calculate_qc_metrics(adata, qc_vars=["mt"], inplace=True) # 可视化质控指标 import seaborn as sns fig, axs = plt.subplots(1, 2, figsize=(12, 4)) sns.distplot(adata.obs["total_counts"], kde=False, ax=axs[0]) sns.distplot(adata.obs["pct_counts_mt"], kde=False, ax=axs[1])

执行过滤的黄金标准：

# 细胞过滤 sc.pp.filter_cells(adata, min_counts=5000) sc.pp.filter_cells(adata, max_counts=35000) adata = adata[adata.obs["pct_counts_mt"] < 20] # 基因过滤 sc.pp.filter_genes(adata, min_cells=10)

空间特异性质控往往被忽视。一个实用的技巧是检查空间坐标上的表达量分布：

sc.pl.spatial(adata, color=["total_counts", "n_genes_by_counts"], alpha=0.7, size=1.2)

3. 标准化与特征选择策略

空间转录组数据的标准化需要特殊考虑。Visium数据由于捕获效率差异，spot间的技术变异更为明显；而MERFISH数据由于是靶向检测，通常更干净但可能受图像分析算法影响。

标准化方法对比表：

Scanpy标准工作流：

# 基础标准化 sc.pp.normalize_total(adata, target_sum=1e4) sc.pp.log1p(adata) # 高变基因选择 sc.pp.highly_variable_genes(adata, flavor="seurat", n_top_genes=2000) adata = adata[:, adata.var.highly_variable]

对于空间数据，特别推荐检测空间变异基因（SVGs）。这需要使用SpatialDE等专用工具：

# 安装空间分析工具 !pip install SpatialDE # 准备输入数据 counts = pd.DataFrame(adata.X.todense(), columns=adata.var_names, index=adata.obs_names) coord = pd.DataFrame(adata.obsm['spatial'], columns=['x', 'y'], index=adata.obs_names) # 运行空间差异分析 import SpatialDE results = SpatialDE.run(coord, counts) top_svgs = results.sort_values('qval').head(50)['g']

4. 降维聚类与空间模式解析

空间转录组分析的核心价值在于将分子特征映射回组织结构。与传统单细胞分析相比，我们需要在降维聚类中特别关注空间连续性。

标准分析流程七步法：

1. PCA降维：sc.pp.pca(adata)
2. 邻域图构建：sc.pp.neighbors(adata)
3. UMAP可视化：sc.tl.umap(adata)
4. Leiden聚类：sc.tl.leiden(adata)
5. 标记基因鉴定：sc.tl.rank_genes_groups()
6. 空间可视化：sc.pl.spatial()
7. 功能注释：基于标记基因的GO分析

执行基础分析的完整代码：

# 标准降维聚类 sc.pp.pca(adata) sc.pp.neighbors(adata) sc.tl.umap(adata) sc.tl.leiden(adata, resolution=0.6) # 可视化 sc.pl.umap(adata, color=["leiden", "total_counts"])

空间特异性的分析技巧是检查聚类结果的空间分布：

sc.pl.spatial(adata, img_key="hires", color="leiden", size=1.5, alpha=0.8)

对于感兴趣的空间模式，可以进一步进行区域特异性分析：

# 选择特定空间区域 x_min, x_max = 3000, 5000 y_min, y_max = 2000, 4000 region_mask = (adata.obsm['spatial'][:,0] > x_min) & \ (adata.obsm['spatial'][:,0] < x_max) & \ (adata.obsm['spatial'][:,1] > y_min) & \ (adata.obsm['spatial'][:,1] < y_max) adata_region = adata[region_mask].copy() # 区域特异性聚类 sc.tl.leiden(adata_region, key_added="sub_clusters")

5. MERFISH数据处理专项技巧

MERFISH数据虽然与Visium同属空间转录组，但在处理上有其独特之处。由于是成像技术，数据通常更稀疏但分辨率更高，需要调整分析方法。

MERFISH数据处理四步优化：

1. 归一化策略：采用CPM而非文库大小校正
2. 特征选择：优先使用已知标记基因
3. 降维参数：减少PCA组分数目（10-15）
4. 聚类分辨率：调低Leiden分辨率参数

典型MERFISH分析流程：

# 专用预处理 sc.pp.normalize_per_cell(adata_merfish, counts_per_cell_after=1e6) sc.pp.log1p(adata_merfish) # 适度降维 sc.pp.pca(adata_merfish, n_comps=15) sc.pp.neighbors(adata_merfish) # 保守聚类 sc.tl.leiden(adata_merfish, resolution=0.3) # 空间可视化 sc.pl.embedding(adata_merfish, basis="spatial", color="leiden", palette="Set1")

MERFISH数据特别适合分析细胞间相互作用。一个实用技巧是计算邻近细胞类型的共现频率：

from sklearn.neighbors import NearestNeighbors # 计算邻近细胞类型 nbrs = NearestNeighbors(n_neighbors=5).fit(adata_merfish.obsm['spatial']) distances, indices = nbrs.kneighbors(adata_merfish.obsm['spatial']) # 统计邻近关系 cluster_pairs = [] for i in range(len(indices)): for j in indices[i][1:]: # 跳过自身 cluster_pairs.append( (adata_merfish.obs.leiden.iloc[i], adata_merfish.obs.leiden.iloc[j]) ) # 生成共现矩阵 co_occurrence = pd.crosstab( pd.Series([x[0] for x in cluster_pairs]), pd.Series([x[1] for x in cluster_pairs]) )

6. 高级可视化与结果解读

优秀的可视化能让空间转录组数据自己"讲故事"。除了标准绘图外，Scanpy支持多种高级展示技巧。

空间可视化工具箱：

展示空间梯度模式的技巧：

# 创建空间坐标衍生特征 adata.obs['x_coord'] = adata.obsm['spatial'][:,0] adata.obs['y_coord'] = adata.obsm['spatial'][:,1] # 检查基因表达的空间趋势 sc.pl.spatial(adata, color=["x_coord", "y_coord", "Pcp4"], ncols=3, size=1.3)

对于多切片分析，可以使用scanpy的AnnData拼接功能：

# 合并多个样本 import anndata adatas = [adata_sample1, adata_sample2] adata_combined = anndata.concat(adatas, label="sample", keys=["sample1", "sample2"]) # 批次校正 sc.pp.combat(adata_combined, key="sample")

交互式可视化可以极大提升探索效率。虽然Scanpy本身不支持，但可以导出到Napari：

# 导出为空间数据框架 spatial_df = pd.DataFrame(adata.obsm['spatial'], columns=['x', 'y'], index=adata.obs_names) spatial_df = pd.concat([spatial_df, adata.obs], axis=1) # 保存为CSV spatial_df.to_csv("spatial_coordinates_with_metadata.csv")

7. 疑难解答与性能优化

实际分析中常会遇到各种技术挑战。以下是几个常见问题的解决方案：

问题1：Visium数据质控后细胞数过少

• 可能原因：过滤阈值过严
• 解决方案：检查原始数据质量，调整阈值

# 动态阈值确定 lower_bound = np.percentile(adata.obs['total_counts'], 5) upper_bound = np.percentile(adata.obs['total_counts'], 95)

问题2：MERFISH聚类结果过于碎片化

• 可能原因：分辨率参数过高
• 解决方案：尝试不同分辨率

for res in [0.1, 0.3, 0.5]: sc.tl.leiden(adata, resolution=res, key_added=f"clusters_{res}")

问题3：空间DE分析内存不足

• 可能原因：基因数过多
• 解决方案：预过滤低表达基因

# 保留在至少10%细胞中表达的基因 sc.pp.filter_genes(adata, min_cells=adata.n_obs*0.1)

对于大数据集，可以采用近似算法提升性能：

# 使用近似PCA sc.pp.pca(adata, svd_solver='arpack') # 降低邻域图大小 sc.pp.neighbors(adata, n_neighbors=15)

内存优化技巧包括使用稀疏矩阵和分块处理：

# 转换为稀疏矩阵 from scipy import sparse adata.X = sparse.csr_matrix(adata.X) # 分块处理大型数据 chunk_size = 1000 for i in range(0, adata.n_obs, chunk_size): chunk = adata[i:i+chunk_size] process_chunk(chunk)