NCBI Primary Transcript 程序：处理 RefSeq 蛋白质数据中的异构体以进行直系同源分析

引言

在进行基因组学分析，特别是直系同源（Ortholog）分析时，我们常常会遇到一个关键问题：RefSeq 等权威数据库中的蛋白质数据往往包含同一个基因的多个转录本，即不同的异构体（isoform）。这些异构体虽然源自同一个基因，但具有不同的序列，如果直接用于分析，会导致同一个基因被重复计数，严重影响分析结果的准确性。因此，在进行直系同源分析前，需要将来自同一基因的不同异构体合并，只保留一个代表性的转录本（通常是最长的或主要的转录本）。本文将介绍这一需求，并重点讲解一个用于自动化处理此问题的工具——NCBI Primary Transcript 程序。

先上程序链接：GitHub：原版； 笔者改进版
着急的朋友可以直接跳转，链接里的使用说明也都已经写清～
下面稍微借助ai解释一下为什么要用这个程序。

1. RefSeq 蛋白质数据中的异构体问题

RefSeq（Reference Sequence）数据库为研究人员提供了高质量、注释良好的参考序列。对于一个真核生物基因，由于可变剪接（Alternative Splicing）的存在，通常会生成多个不同的 mRNA 转录本，进而翻译成多个蛋白质异构体。

主要影响：

• 直系同源分析失真：像 OrthoFinder 这样的工具会将每个蛋白质序列视为独立的实体。如果不加处理，来自同一基因的多个异构体会被识别为不同的“基因”，导致直系同源群（Orthogroups）中包含大量实际上是同一基因的冗余序列，从而高估基因家族的大小和复杂度。
• 下游分析偏差：基于错误基因计数的比较基因组学、进化分析等都会产生偏差。

因此，预处理步骤的核心是：将每个基因对应的所有蛋白质异构体合并，只保留一个“主要转录本”（Primary Transcript）。

2. 直系同源分析前的数据合并需求

为了获得准确的直系同源关系，标准的预处理流程要求：

1. 输入标准化：为每个基因提供一个唯一的蛋白质序列。
2. 选择代表序列：通常选择该基因所有异构体中最长的蛋白质序列作为代表。
3. 保持注释一致性：合并过程中，需要从 GFF/GTF 注释文件中提取基因与转录本的对应关系，并确保输出文件的 ID 和注释信息正确无误。

3. 原版 NCBI Primary Transcript 程序

David Emms 为解决 OrthoFinder 分析前的数据准备问题，提供了一个 Python 脚本。该程序的核心功能是读取 NCBI 的基因组注释文件（GFF）和蛋白质序列文件（FASTA），为每个基因筛选出一个主要的蛋白质序列。

原版程序特点与限制：

• 功能：根据 GFF 文件中的基因-转录本对应关系，找出每个基因对应的所有蛋白质异构体，并选择序列最长的一个作为该基因的代表序列输出。
• 输入要求：原版程序设计为处理从 NCBI 下载的、包含.gff和.faa文件的ZIP 压缩包。
• 使用方式：用户需要先下载物种的基因组 ZIP 包，然后运行脚本指定该 ZIP 文件路径。
• 原版链接：该程序的讨论和获取方式详见 GitHub Issue: https://github.com/davidemms/OrthoFinder/issues/930

4. 改进版程序：支持文件夹输入

原版程序强制要求输入为 ZIP 文件，这在某些自动化流水线或处理已解压数据时不够灵活。因此，小编对程序进行了改进。

改进版程序特点：

• 核心改进：允许用户直接输入包含所需.gff和.faa(或.fasta) 文件的文件夹路径，无需再将文件压缩成 ZIP 包。
• 功能增强：保持了原版所有核心功能，同时提高了易用性和与现有文件组织的兼容性。
• 程序路径：改进版程序托管在 GitHub: https://github.com/wsysissi/ncbi_primary_transcript

改进版使用方式：

1. 准备数据：确保你的工作目录下有一个文件夹（例如./data/species_x），里面包含从 NCBI 下载的 GFF 注释文件（如genomic.gff）和蛋白质序列文件（如protein.faa）。

2. 克隆或下载改进版脚本：

   gitclone https://github.com/wsysissi/ncbi_primary_transcript.git

3. 运行程序：

   • 如果是想输入一个文件夹路径，则如下运行：

   python primary_transcript.py--input_dir/path/to/your/data_folder

   --input_dir: 指定包含 GFF 和 FASTA 文件的文件夹路径。

   • 如果是想和原版一样使用，则如下运行：

   python primary_transcript.py--zip_file1

   这样运行需要保证当前文件夹只有你想进行处理的数据一个zip包。

输出结果：
程序运行后，会在输出目录生成一个新的蛋白质文件，其中每个基因只对应一条代表序列。这个文件即可直接用于 OrthoFinder 等直系同源分析工具。

使用建议：

• 始终检查输入 GFF 和 FASTA 文件的格式是否与 NCBI 标准一致。
• 运行后，对比输入和输出的序列数量，确认合并操作已生效。
• 可将此步骤集成到你的基因组分析流程中，实现自动化预处理。