易基因：Bioact Mater/IF20.3：华南理工大学王迎军院士团队RRBS等揭示DNA甲基化调控衰老骨缺损修复新机制

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2026年3月27日，华南理工大学王迎军院士、施雪涛教授、柴牧原助理研究员团队合作，在《Bioactive Materials》期刊发表题为“Epigenetic reprogramming periosteum promotes aging critical segmental bone defect repair via methylation remodeling”高水平科研成果。研究针对衰老人群中常见的临界节段性骨缺损（CSBDs）修复困难这一临床难题，创新性地开发了一种基于表观遗传重编程的人工骨外膜（BFVs-loaded periosteum），该材料可以通过调控DNA甲基化水平，改善衰老临界节段性骨缺损（CSBDs）修复过程中不良的骨微环境和炎症微环境。

本研究开发的人工骨外膜采用三层结构，通过负载幼年小鼠骨折源性细胞外囊泡（BFVs），表现出稳定的BFV释放性能（14天内持续稳定释放）及优异的拉伸性能（模量约0.22 MPa，断裂伸长率约200%）。体外实验表明，BFV负载骨外膜的提取液可显著降低衰老骨髓间充质干细胞（BMSCs）中的衰老标志物（β-gal、γH2A.x、p16、p21）水平，同时促进成骨分化。同时，该材料还可调控巨噬细胞向抗炎M2表型极化，并抑制破骨细胞形成。在衰老小鼠股骨CSBDs模型中，BFV负载骨外膜联合3D打印支架维持了植入物结构完整性，并显著增强骨再生，修复效果达到与成年小鼠相当的水平。更重要的是，该研究通过简化基因组DNA甲基化测序（RRBS）揭示，BFVs负载骨外膜通过促进基因体（genebody）区域的DNA甲基化重塑，特别是上调了抗衰老关键转录因子Foxo3基因的甲基化水平，从而实现对衰老骨微环境的表观遗传重编程，进而逆转骨骼衰老。该骨外膜有效连接3D打印支架与宿主骨之间的力学适配性，同时通过表观遗传调控逆转衰老骨微环境，为衰老骨骼损伤的治疗提供了前景广阔的策略。

DOI:10.1016/j.bioactmat.2026.03.036

英文标题：Epigenetic reprogramming periosteum promotes aging critical segmental bone defect repair via methylation remodeling

译文标题：表观遗传重编程骨外膜通过甲基化重塑促进衰老临界性骨缺损修复

发表时间：2026年3月27日

发表期刊：生物活性材料（Bioactive Materials）

影响因子：IF20.3/Q1

技术平台：RRBS

作者单位：华南理工大学

研究亮点

• 一种生物活性骨外膜将衰老小鼠临界节段性骨缺损的修复能力恢复至成年小鼠水平。
• 该生物活性骨外膜通过调控干细胞和巨噬细胞，改善衰老骨微环境。
• 功能机制研究揭示该生物活性骨外膜通过基因体DNA甲基化重塑实现表观遗传重编程。

图形摘要

研究方法

（1）材料构建与表征

BFVs提取与鉴定：从幼年小鼠骨折模型血清中提取细胞外囊泡（BFVs）。通过透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒追踪分析（NTA）和Western Blot对其进行形态、粒径和标志物（Cd9和Cd63）鉴定。

人工骨外膜制备：分层制备PVA牺牲层（提供冻干后的硬度，便于手术缝合）、PCL机械支撑层（增强整体力学适应性，防止软组织长入）和GelMA功能层（负载BFVs，实现缓释）。在GelMA层中，可选择性地负载或不负载BFVs，形成P-BFVs组和P-Blank（对照组）骨外膜。通过紫外光交联固化GelMA层。

材料表征：使用扫描电子显微镜观察微观结构；通过共聚焦显微镜观察BFVs分布；在模拟体液中测定BFVs的体外释放曲线（共14天）；使用万能材料试验机测量其拉伸力学性能（拉伸模量、断裂伸长率等）。

3D打印支架设计与制备：设计并打印两种β-磷酸三钙（β-TCP）生物陶瓷支架，分别用于体外细胞实验和体内股骨CSBD模型。

（2）体外细胞实验

细胞模型：从20月龄衰老模型C57BL/6小鼠股骨中分离原代衰老BMSCs；RAW 264.7细胞系作为巨噬细胞极化研究模型。

功能评估：CCK-8检测细胞增殖；ALP、ARS染色评估成骨分化；SA-β-gal染色评估细胞衰老；流式细胞术检测巨噬细胞（M1/M2）极化和ROS水平；TRAP染色评估破骨细胞形成。

基因与蛋白表达：qPCR检测衰老、成骨、炎症、破骨相关基因（Il6, P16, Runx2, Col1, Tnfα, Trap等）的mRNA表达；免疫荧光和免疫组化检测相关蛋白（β-gal, γH2A.x, Runx2, Col1, Foxo3）表达。

（3）动物实验（衰老小鼠CSBDs模型）

模型构建：在18月龄（衰老）和6月龄（成年）C57BL/6小鼠股骨上构建临界性骨缺损模型。

分组干预：分为MS组（仅3D打印支架）、MSP-Blank组（成年小鼠+支架+无BFVs骨外膜）、SSP-Blank组（衰老小鼠+支架+无BFVs骨外膜）、SSP-BFVs组（衰老小鼠+支架+BFVs骨外膜）。

体内示踪：使用DiD标记BFVs，通过IVIS小动物活体成像系统监测其在体内的分布。

疗效评估：植入12周后，通过micro-CT对骨痂进行三维重建和定量分析；通过H&E、Masson染色评估新生骨组织和材料整合情况。

（4）表观遗传学与机制验证

RRBS测序分析：提取SSP-Blank和SSP-BFVs两组CSBDs愈合组织（骨痂）的DNA，进行RRBS甲基化测序并鉴定差异甲基化区域（DMRs）、分析甲基化在启动子/基因体等不同功能区的分布特征、对差异甲基化基因进行GO和KEGG富集分析。

靶点验证：通过qPCR、IF和IHC验证关键基因Foxo3的表达；使用siRNA沉默Foxo3，通过功能挽救实验验证其对材料疗效的必要性。

关键结果

（1）负载BFVs的骨外膜构建与表征

研究人员成功构建了由PVA、PCL和GelMA组成的三层结构人工骨外膜。其中，GelMA功能层内均匀分布着从幼年小鼠骨折血清中提取的BFVs。扫描电镜清晰地展示了其冻干状态下的三层结构。释放曲线显示，BFVs能够从GelMA层中持续释放长达14天，初期有少量突释，随后进入平稳缓释阶段，总释放率接近80%，为长效调控衰老微环境提供了基础。（图1）

图1：BFVs负载骨外膜材料的构建、表征及拉伸力学性能

（2）基于RRBS测序的衰老小鼠CSBD骨痂表观遗传学分析

为揭示深层机制，研究者对SSP-BFVs组和SSP-Blank组的CSBD愈合组织（骨痂组织）进行了RRBS测序。结果显示，两组之间存在显著的DNA甲基化差异，特别是在CpG位点鉴定出174个高甲基化基因和24个低甲基化基因。这些CpG DMRs的片段长度主要分布在200-400bp之间（图2），并表现出全基因组范围内的甲基化水平差异（图3）。对DMRs的基因组区域分布分析发现，与启动子区域的甲基化差异不显著相比，基因体（genebody）区域的甲基化水平在SSP-BFVs组中表现出显著的升高趋势（尤其是在外显子区域），这提示BFVs可能通过增加基因体甲基化来调控基因表达，从而促进衰老组织的修复（图4A）。这表明该材料的表观调控作用可能通过调控基因体甲基化水平来影响转录延伸和剪接效率，从而实现对复杂基因网络的精细调控。这一发现是理解其逆转衰老作用的全新视角。

图2：RRBS鉴定出的DMRs

图3：CpG位点的DMRs圈图

图4：基于RRBS测序的生信分析及关键高甲基化基因Foxo3的鉴定

（3）Foxo3基因甲基化水平升高可能是负载BFVs骨外膜改善衰老骨微环境的关键

基于RRBS测序数据，结合GO和KEGG通路富集分析（图4C-D），研究者聚焦于基因体区域高甲基化的关键基因——Forkhead Box O3 (Foxo3)，该基因与细胞衰老、氧化应激和成骨分化密切相关（图4B）。体外qPCR和IF实验证实，P-BFVs提取物能显著促进衰老BMSCs和RAW264.7细胞中Foxo3的mRNA和蛋白表达（图4E-J）。体内IHC染色也显示，SSP-BFVs组骨痂内细胞的Foxo3表达显著高于SSP-Blank组（图4K）。这些结果揭示BFVs骨外膜通过增加Foxo3基因体的甲基化水平，促进其稳定表达，从而发挥下游一系列抗衰老和促修复功能（图5）。

图5：RRBS数据中与Foxo3基因相关的GO和KEGG富集分析揭示其在髓系细胞分化和骨髓系细胞稳态中的关键调控作用，表明其在多种病理生理过程中的重要性

（3）Foxo3基因甲基化水平升高可能是负载BFVs骨外膜改善衰老骨微环境的关键

基于RRBS测序数据，结合GO和KEGG通路富集分析（图4C-D），研究者聚焦于基因体区域高甲基化的关键基因——Forkhead Box O3 (Foxo3)，该基因与细胞衰老、氧化应激和成骨分化密切相关（图4B）。体外qPCR和IF实验证实，P-BFVs提取物能显著促进衰老BMSCs和RAW264.7细胞中Foxo3的mRNA和蛋白表达（图4E-J）。体内IHC染色也显示，SSP-BFVs组骨痂内细胞的Foxo3表达显著高于SSP-Blank组（图4K）。这些结果揭示BFVs骨外膜通过增加Foxo3基因体的甲基化水平，促进其稳定表达，从而发挥下游一系列抗衰老和促修复功能（图5）。

图6：BFVs负载骨外膜在缓解siFoxo3对原代衰老BMSCs和RAW 264.7细胞影响中的作用

结论和启示

本研究成功开发了一种具有表观遗传重编程能力的负载BFVs人工骨外膜，该系统能与3D打印支架协同，通过上调基因体DNA甲基化水平，特别是激活Foxo3这一“长寿基因”，系统性逆转衰老骨微环境的病理状态，使衰老小鼠骨修复能力恢复至成年小鼠水平。

RRBS测序在本研究中的重要作用

• 全基因组甲基化图谱绘制。系统描绘了衰老CSBDs骨痂在负载BFVs人工骨外膜干预后的DNA甲基化组变化，鉴定出174个CpG高甲基化基因和24个低甲基化基因，为后续机制研究提供数据资源。
• 关键调控区域的精准定位。本研究RRBS数据揭示该材料的主要表观遗传效应发生在基因体区域而非启动子区域，拓展了对生物材料表观遗传调控模式的认知。
• 关键靶基因的筛选与验证。成功筛选出Foxo3作为关键调控因子，并通过甲基化抑制剂实验和siRNA功能挽救实验完成从“相关性”到“因果性”的机制验证闭环。
• 为生物材料设计提供表观遗传学理论基础。建立“材料-DNA甲基化重塑-关键基因表达-细胞功能逆转”的完整证据链，为下一代具有表观遗传调控功能的智能生物材料设计提供分子靶点和理论依据。

参考文献：

Zheng J, Ke J, Wu S, Lan Y, Zhong Z, Yang S, Zhao N, Wang Z, Chai M, Shi X, Wang Y. Epigenetic reprogramming periosteum promotes aging critical segmental bone defect repair via methylation remodeling. Bioact Mater. 2026 Aug;62:759-775. doi: 10.1016/j.bioactmat.2026.03.036.