生成matrix | cellranger | seeksoultools
官网教程：https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/downloads
一、下载cellranger
1、下载安装包
下载安装包 curl -o cellranger-10.0.0.tar.gz "https://cf.10xgenomics.com/releases/cell-exp/cellranger-10.0.0.tar.gz?Expires=1767727346&Key-Pair-Id=APKAI7S6A5RYOXBWRPDA&Signature=O52tyC~3GoEhwFQBlI3z8byK-tU3-DnUzF89wlVP4bO03KIci0PHpFjzco44QBbFrkSMtVl0UXrUuBZID1ixExgHX1nsa~lxJAL1v9K6QfrwB1CqpIuzY7uvEzk5QRzi5zl9j9kfoM2wimgs9~ZfolEvSky3Nc107ZBrISsbBPJWMjEbnbk34zMH9gSsFZUcFJND1~BAwGvFziUI0Dyp2fwQmVBP08I8dKBulyjZkyIojFdYKKY38v8uehVHwR5P6jLL-Kblk8DW2WF6vEL06HitiScsmWum52xJQdsoumSO7HJgDAuuu5t-dKOFDWslB9LOz-COrGm1ZyvNGilXAA__" #解压 tar -xzvf cellranger-10.0.0.tar.gz这个文件有9GB，下载时间很长，可以放后面一点开始下载
#下载安装包 curl -O "https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCm39-2024-A.tar.gz"2、安装
cd cellranger-10.0.0/ #输出当前路径 pwd/data/hkl/software/cellranger/cellranger-10.0.0
vim ~/.bashrc #把路径加入~/.bashrc文件，下次开机也能找到软件路径 export PATH=/data/hkl/software/cellranger/cellranger-10.0.0:$PATH输入：cellranger
输出：
输入：cellranger testrun --id=check_install
输出：
二、生成matrix
参考：(77 封私信 / 41 条消息) 深度解析Cell Ranger：从FASTQ到Count矩阵，一篇精通cellranger count｜使用生信云,分析更省心 - 知乎
https://blog.csdn.net/pumc_2023/article/details/154074323
cellranger count --id=E15-5-skin_merged --create-bam true --transcriptome=/data/hkl/software/cellranger/refdata-gex-GRCm39-2024-A/ --fastqs=/data/hkl/tissue/rna/skin_E15.5/data/merged/ --sample=E15_skin --localcores=20 --localmem=64 --nosecondaryAn extremely low rate of correct barcodes was observed for all the candidate chemistry choices for the input: Sample E15_skin in "/data/hkl/tissue/rna/skin_E15.5/data/merged". Please check your input data.
- 0.1% for chemistry SC3Pv3-CS1
- 0.1% for chemistry SC3Pv3HT-CS1
- 0.0% for chemistry SC3Pv3-polyA
- 0.0% for chemistry SC3Pv3HT-polyA
- 0.0% for chemistry SC3Pv4-polyA
- 0.0% for chemistry SC3Pv4-CS1
- 0.0% for chemistry SC5P-R2-v3
- 0.0% for chemistry SC5P-R2
- 0.0% for chemistry SC3Pv2
- 0.0% for chemistry SC3Pv3LT
- 0.0% for chemistry ARC-v1
报错，发现对不上cellranger 中 illumina 的barcode
1、一开始以为是没有cutadapt，导致识别不到barcode
剪切：https://www.jieandze1314.com/post/cnposts/scrna-4/
cellranger count --id=E15-5-skin_merged --create-bam true --transcriptome=/data/hkl/software/cellranger/refdata-gex-GRCm39-2024-A/ --fastqs=/data/hkl/tissue/rna/skin_E15.5/data/merged/ --sample=E15_skin --localcores=20 --localmem=64 --nosecondary --r1-length=28 --r2-length=91加上了参数 --r1-length=28 --r2-length=91，表明barcode位置
排除mapping的问题：虽然R1在28bp后是一长串T，但是mapping是在R2上，R2作为转录的reads进行mapping，R2的原始文件没有低质量碱基，应该不是mapping的问题
2、把报错信息查了一下，发现别人也有这个问题，不能用cellranger拆
https://mp.weixin.qq.com/s/DMRVuVc635XyPmDz1lSQDA
看了这个数据是用寻因的试剂盒
寻因试剂盒中生成matrix的软件是 seeksoultools
寻因官网的教程：http://seeksoul.seekgene.com/zh/v1.3.0/0.download.html
生信菜鸟团写的教程：https://mp.weixin.qq.com/s/Y45OO0STJAY9vX5Wsy7Jrb
(1)下载seeksoultools：
mkdir seeksoultools.1.2.2 cd seeksoultools.1.2.2 wget -c -O seeksoultools.1.2.2.tar.gz "https://seekgene-public.oss-cn-beijing.aliyuncs.com/software/seeksoultools/seeksoultools.1.2.2.tar.gz" #软件路径加入系统文件 pwd vim ~/.bashrc #测试 ./seeksoultools --version(2)seeksoultools 生成matrix：
seeksoultools rna run --fq1 "/data/hkl/tissue/rna/skin_E15.5/data/merged/E15_skin_S1_L001_R2_001.fastq.gz" \ --fq2 "/data/hkl/tissue/rna/skin_E15.5/data/merged/E15_skin_S1_L001_R1_001.fastq.gz" \ --samplename E15-5_skin --genomeDir /data/hkl/software/seeksoultools_refdata/mm10/star/ \ --gtf "/data/hkl/software/seeksoultools_refdata/mm10/genes/genes.gtf" \ --chemistry DDV2 \ --core 16 \ --include-introns--include-introns 是否要包含内含子：https://mp.weixin.qq.com/s/Bw7KKsQYNJYwsjXzHHufDw
另外要注意一个实际问题：Cell Ranger 7 默认“include-introns=true”，而早期版本默认 false。跨项目对比时要特别小心，别混着用。
seeksoultools rna run \ --fq1 260104/E15-5-skin_S1_L001_R1_001.fastq.gz \ --fq1 260104/E15-5-skin_S1_L002_R1_001.fastq.gz \ --fq1 250928/E15-5-skin_S1_L003_R1_001.fastq.gz \ --fq2 260104/E15-5-skin_S1_L001_R2_001.fastq.gz \ --fq2 260104/E15-5-skin_S1_L002_R2_001.fastq.gz \ --fq2 250928/E15-5-skin_S1_L003_R2_001.fastq.gz \ --samplename E15-5_skin_3 \ --genomeDir /data/hkl/software/seeksoultools_refdata/mm10/star/ \ --gtf "/data/hkl/software/seeksoultools_refdata/mm10/genes/genes.gtf" \ --chemistry DDV2 \ --core 30 \ --include-introns三、问题：将加测前和加测后的fastq文件都输入seeksoultools，拆分单细胞得到的细胞数 < 将加测前的fastq文件单独输入seeksoultools，拆分单细胞得到的细胞数
因为每条reads带有的barcode都会指向唯一的细胞，在加测后只会多细胞，不会少细胞
问寻因公司得到的回复是：
新增数据让低质量细胞的判定更精准，因此识别的细胞少了些。（感觉有问题，barcode不会变？属于每个细胞的reads加测后只会多，不会少）。其次，两次的软件版本不一致，但是这个没关系，这两个版本对于识别细胞的部分没有改动。
加测前是单通道的上机 -> 得到一对fastq文件
加测后是双通道或三通道的上机-> 得到两对或三对fastq文件
test：1、cat加测前后的fastq文件 2、cat加测后的多通道fastq文件 3、不cat、全部单独输入
分别作为seeksoultools的输入文件，发现生成的matrix是一样大的