一、准备
1. 三张表：样本特征信息、表达矩阵、基因注释信息
2. 表达矩阵
获得方法：
- 表达芯片：敏感度低、范围小、只检测已知转录本、低成本
- RNA-seq：
二、测序数据标准分析：获得表达矩阵
1.spliced alignment比对
（1）比对到基因组
将转录本（RNA）比对到参考基因组（DNA），有的read比对到上一段外显子末尾、下一段开始，中间的内含子把read切开
bwa、tophat->hisat->hisat2（推荐用最新的hisat2）、STAR[效果非常好，比对慢、耗内存]
主流软件：
- hisat2：做动植物方向，基因组本身精度不高，再提升精度意义小
- STAR：做人的方向，对精度要求高，推荐
（2）比对到转录组：Bowtie2
（3）比对结果统计
mapped reads：使用现有主流软件比对率>80% ，低的原因：
- ①参考基因组质量差；
- ②测序样本污染，测到细菌RNA；
- ③参考基因组品种与测序品种差异大
uniquely mapped reads：只在参考基因组/转录组匹配到唯一位置，基因表达定量分析（如使用featureCounts、HTSeq、RSEM等工具）中，通常只使用uniquely mapped reads来计算每个基因或转录本的计数。
2. quantification表达定量
比对时只是将测序数据和参考基因组比对，未统计比对到哪一个基因
问题1：多处比对的reads如何分配？一个reads比对到两个以上的基因位置，
- 扔掉：多拷贝基因表达量被低估
- 一边各一半：0.5+0.5
- 计算概率，按概率分配：0.7+0.3
问题2：在基因层次还是isoform层次定量？
一般不同isoform功能相似，建议在基因层次定量
3. normalization标准化
reads counts：比对和定量完后，被明确归属于某个特定基因（或转录本、外显子等基因组特征）的测序读数（reads）的数量。
问题1：在样本1中，基因B的表达量比基因A高?
不确定，因为基因长度不同。越长碎片越多
问题2：基因A在样本3中的表达比样本2中高?
不确定，测序深度不一样。
（1）标准化
- fpkm：比对到基因的片段数/基因长度/总片段数
- tpm：比对到基因的片段数/基因长度/标准化后的总片段数
（2）校正
问题3：一个基因表达异常高导致其他基因表达低，解决方法：
- 内参基因：不同组织、不同条件下表达稳定。计算使各个样本中数值一样，如样本一：3，样本二：6，所有样本一数据都×系数2
- 非常见物种，未研究内参基因。假设大多基因是没有差异表达的（TMM），×校正系数后使多数基因表达水平相同