大鼠外周血中性粒细胞（PBNC）的分离鉴定protocol 云克隆来助力

大鼠外周血中性粒细胞（PBNC）的分离

一、简介

白细胞根据形态差异可分为颗粒和无颗粒两大类，颗粒白细胞（粒细胞）中含有特殊染色颗粒，用瑞氏染料染色可分辨出三种颗粒白细胞即中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞；无颗粒白细胞包括单核细胞和淋巴细胞。中性粒细胞(Neutrophils)在血液的非特异性免疫中起着十分重要的作用，它处于机体抵御微生物病原体，特别是在化脓性细菌入侵的第一线，具有很强的吞噬活性，可吞噬细菌、衰老的红细胞、抗原一抗体复合物和坏死的细胞等。中性粒细胞内含有大量溶酶体酶，因此能将吞噬入细胞内的细菌和组织碎片彻底分解。

中性粒细胞具有分叶形或杆状的核，胞浆内含有大量既不嗜碱也不嗜酸的中性细颗粒，这些颗粒多是溶酶体，内含髓过氧化酶、溶菌酶、碱性磷酸酶和酸性水解酶等丰富的酶类，与细胞的吞噬和消化功能有关。中性粒细胞是人体内寿命最短的细胞，一般体外培养12-24h内活性稳定，48h活性下降，96h基本死亡。在吉姆萨（Giemsa）染色血涂片中，中性粒细胞细胞核呈蓝紫色，可观察到不同的核形态。

二、材料：

1、实验动物：成年SD大鼠（每只可抽取8~15ml外周血）

2、组织来源：外周血

3、手术器材：手术剪（镊）、解剖镊、酒精脱脂棉签、采血针、采血管（含EDTA-2K）

4、试剂：Histopaque-1077分离液（sigma，10771），Histopaque-1119分离液（sigma，11191）PBS缓冲液，红细胞裂解液

三、实验步骤

1. 麻醉大鼠后，剪开腹腔，暴露出下腔动脉，用采血针和含抗凝剂的采血管收集血液，期间摇晃采血管防止血液凝固。可使用的抗凝剂有肝素（15-30 U/ml全血）、EDTA（1.25-1.75 mg/ml全血）。

2. 将全血和等体积的PBS混合稀释，20℃条件下800g离心10分钟。

3. 血液分层后，收集白膜层到新的离心管中，将白膜层用PBS稀释2~4倍用于后续分离。（吸取的白膜层体积=血样原体积/5）。

4. 先在15ml离心管中加入3ml Histopaque-1119，再缓慢加入3ml Histopaque-1077，最后加入3~4ml稀释后的样品，20℃下1000g离心30min。注意两层分离液之间应有明显的分界线，不应互相混合，而血液层与分离液间的轻微扩散不影响分离结果。

5. 吸取Histopaque-1077和Histopaque-1119两层之间的白色粒细胞层，应注意不要被Histopaque-1077和血浆层间的细胞带（主要为PBMC）污染。

6. 将收集的粒细胞用PBS洗涤一次，镜下观察和计数后，直接用于实验或冻存。高纯度的中性粒细胞沉淀为白色，若有少许红色，可离心后加入少许红细胞裂解液以去除红细胞，再次离心并用PBS清洗一次。

注意事项：

1.使用未稀释的白膜层或全血进行密度梯度离心会导致分离后的粒细胞层有较多的红细胞污染。

1. 分离液需要在室温状态下使用，所以应提前将保存在2-8℃的分离液取出复温。
2. 离心机温度保持室温，设定到4℃会导致分离效果变差。
3. 使用塑料离心管会导致部分细胞粘附在管壁上，收集时可观察到管壁浑浊。

全血离心后出现白膜层（红细胞上方的灰白色细胞带）

• 中性粒细胞的鉴定

白光（200X）

Giemsa Stain（400X）

参考文献(主要参考第一篇）

1. Ohms M, Möller S, Laskay T. An Attempt to Polarize Human Neutrophils Toward N1 and N2 Phenotypes in vitro. Front Immunol. 2020;11:532.doi:10.3389/fimmu.2020.00532
2. Krémer V, Godon O, Bruhns P, et al. Isolation methods determine human neutrophil responses after stimulation. Front Immunol. 2023 Nov 24;14:1301183. doi: 10.3389/fimmu.2023.1301183. PMID: 38077317; PMCID: PMC10704165.
3. Swamydas M, Luo Y, Dorf ME, et al. Isolation of Mouse Neutrophils. Curr Protoc Immunol. 2015 Aug 3;110:3.20.1-3.20.15. doi: 10.1002/0471142735.im0320s110. PMID: 26237011; PMCID: PMC4574512.
4. Ubags NDJ, Suratt BT. Isolation and Characterization of Mouse Neutrophils. Methods Mol Biol. 2018;1809:45-57. doi: 10.1007/978-1-4939-8570-8_4. PMID: 29987781.

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