犬脑星形胶质细胞（BA）原代细胞制备方案 云克隆提供优质犬细胞
犬脑星形胶质细胞（BA）原代细胞制备方案
犬原代脑星形胶质细胞（BA），这是一种常用于神经科学研究的重要工具。特别是因为犬在进化上与人类更接近，犬源细胞模型在模拟人类神经生理与病理机制方面，具有比传统啮齿动物模型更高的临床转化价值。
一、实验目的
从健康犬大脑皮层组织中分离、纯化获得高纯度、高活性的原代星形胶质细胞（BA），保留其体内生理形态与功能，为中枢神经系统相关科研实验提供可靠的细胞模型。
二、实验原理
星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多的胶质细胞，主要分布于大脑皮层，具有贴壁生长的特性。利用胰蛋白酶、胶原酶等消化酶解离大脑皮层组织，获得单细胞悬液，通过差速贴壁法去除成纤维细胞等杂细胞，结合培养基筛选，使星形胶质细胞增殖纯化，最终获得高纯度的原代BA细胞。
三、实验材料与试剂
3.1 实验动物
1-2月龄健康家比格犬，体重0.5-1kg，雌雄不限，实验前禁食12h，自由饮水。
3.2 主要试剂
无钙镁PBS缓冲液（pH7.2-7.4）：提前灭菌，4℃预冷。
消化液：0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液、Ⅱ型胶原酶（终浓度1mg/mL），过滤灭菌，现配现用。
完全培养基：DMEM/F12（1:1）基础培养基，添加10%胎牛血清（FBS，灭活）、1%星形胶质细胞生长补充剂、1%双抗（青霉素100U/mL+链霉素100μg/mL），过滤灭菌，4℃保存。
D-Hank's液：灭菌后4℃预冷，用于冲洗组织。
0.4%台盼蓝染色液：用于检测细胞活性。
GFAP抗体（一抗）、荧光二抗：用于细胞鉴定。
其他：75%酒精、无菌生理盐水、二甲苯、多聚甲醛（4%）等。
3.3 实验器材
超净工作台、生物安全柜、CO₂培养箱（37℃、5%CO₂）、高速离心机、倒置显微镜、无菌手术器械（剪刀、镊子、解剖针、培养皿、离心管、移液管）、细胞计数板、无菌滤器（0.22μm）、恒温水浴锅等，所有器材均需高压灭菌或无菌处理。
四、实验步骤（无菌操作）
4.1 动物麻醉与脑组织取材
动物麻醉：采用腹腔注射戊巴比妥钠（30mg/kg），待犬角膜反射消失、肌肉松弛后，确认麻醉成功。
消毒处理：将麻醉后的犬仰卧固定，颈部及头部用75%酒精反复消毒3次，避免污染。
脑组织分离：沿颈部正中切口，分离皮肤、肌肉，暴露颅骨，用无菌剪刀小心剪开颅骨，剥离硬脑膜、软脑膜，用无菌镊子取出完整大脑，放入预冷的无钙镁PBS缓冲液中，快速冲洗2-3次，去除表面血液及结缔组织。
大脑皮层分离：在无菌培养皿中，用解剖针剥离大脑皮层（去除小脑、脑干及海马组织），将皮层组织剪成1-2mm³的细小组织块，用D-Hank's液冲洗3次，弃去上清液。
4.2 组织消化与单细胞悬液制备
向组织块中加入预温至37℃的消化液（0.25%胰蛋白酶-EDTA与Ⅱ型胶原酶按1:1混合），消化液体积为组织块体积的3-5倍，放入37℃恒温水浴锅，振荡消化30-40min，期间每10min轻轻吹打1次，使组织块充分解离。
终止消化：加入等体积的完全培养基，轻轻吹打混匀，终止胰酶与胶原酶的消化作用。
过滤离心：将消化后的混合液用200目无菌滤网过滤，去除未消化的组织碎片，收集 filtrate 于无菌离心管中，1000r/min、4℃离心5min，弃去上清液。
细胞重悬：向离心管中加入5mL完全培养基，用移液管轻轻吹打，使细胞充分分散，制成单细胞悬液。
细胞计数与活性检测：取10μL单细胞悬液，与10μL台盼蓝染色液混合，滴加至细胞计数板，倒置显微镜下计数，计算细胞浓度及活性（活性≥85%方可用于后续培养）。
4.3 细胞接种与原代培养
接种：将单细胞悬液调整浓度至5×10⁵个/mL，接种于预先包被多聚赖氨酸的T25培养瓶中，每瓶加入5mL完全培养基，轻轻摇匀，使细胞均匀分布。
培养：将培养瓶放入CO₂培养箱中，37℃、5%CO₂、95%湿度条件下静置培养，培养前24h不更换培养基，避免影响细胞贴壁。
首次换液：培养24h后，倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，若大部分细胞贴壁（贴壁率≥80%），弃去旧培养基，用预温的无钙镁PBS缓冲液冲洗2次，加入新鲜完全培养基，继续培养。
常规培养：后续每2-3天更换1次完全培养基，观察细胞形态变化，及时去除漂浮的死细胞及杂质。
4.4 细胞纯化（差速贴壁法）
当原代培养细胞融合度达到60%-70%时，弃去培养基，用无钙镁PBS冲洗2次，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，37℃消化5-8min，倒置显微镜下观察到细胞变圆、脱落时，加入完全培养基终止消化。
离心收集：1000r/min、4℃离心5min，弃去上清液，用完全培养基重悬细胞。
差速贴壁：将细胞悬液接种于新的培养瓶中，放入CO₂培养箱中静置培养1-2h，此时成纤维细胞等杂细胞优先贴壁，星形胶质细胞仍处于悬浮状态。
收集纯化细胞：轻轻吸出培养瓶中的上清液（含悬浮的星形胶质细胞），离心后重悬，接种于新的培养瓶中，继续培养，重复1-2次，可获得高纯度的星形胶质细胞。
Fig. Morphology of Canine Brain Astrocytes (Optical microscope,×100)
4.5 细胞鉴定（GFAP免疫荧光染色法）
细胞爬片：将纯化后的星形胶质细胞接种于预先包被多聚赖氨酸的盖玻片上，培养至细胞融合度达到70%-80%。
固定：弃去培养基，用PBS冲洗3次，每次5min，加入4%多聚甲醛固定30min，PBS冲洗3次。
通透：加入0.1% Triton X-100，室温孵育15min，PBS冲洗3次。
封闭：加入5%牛血清白蛋白（BSA），室温封闭30min，弃去封闭液，无需冲洗。
一抗孵育：加入稀释后的GFAP一抗，4℃孵育过夜，PBS冲洗3次，每次5min。
二抗孵育：加入荧光标记的二抗，室温避光孵育1h，PBS冲洗3次。
染色与观察：滴加DAPI染色液，室温避光孵育5min，PBS冲洗3次，抗荧光淬灭剂封片，倒置荧光显微镜下观察，GFAP阳性细胞呈绿色荧光，DAPI染色细胞核呈蓝色，计算阳性率（阳性率≥90%为合格）。
Fig. Immunofluorescence identification of GFAP specific antibody (×200)
4.6 细胞冻存与复苏
4.6.1 冻存
当细胞融合度达到80%-90%时，消化收集细胞，离心后弃去上清液，加入预冷的冻存液（90%FBS+10%DMSO），调整细胞浓度至1×10⁶个/mL，分装于冻存管中，做好标记，程序降温（4℃30min→-20℃1h→-80℃过夜→液氮长期保存）。
4.6.2 复苏
从液氮中取出冻存管，快速放入37℃恒温水浴锅，快速解冻（1-2min内完全融化），1000r/min离心5min，弃去冻存液，用完全培养基重悬细胞，接种于培养瓶中，培养24h后换液，观察细胞复苏情况。
五、注意事项
全程严格遵循无菌操作，实验器材、试剂均需灭菌处理，避免细菌、支原体污染；超净工作台、生物安全柜使用前需紫外消毒30min。
脑组织取材需快速，全程在冰上操作，避免组织缺血、缺氧导致细胞活性下降；消化时间需严格控制，避免消化过度损伤细胞。
细胞接种密度不宜过高或过低，5×10⁵个/mL为最佳，过高易导致细胞堆积，过低影响贴壁与增殖。
差速贴壁时，贴壁时间需准确控制，避免杂细胞去除不彻底或星形胶质细胞流失，影响细胞纯度。
免疫荧光染色时，一抗、二抗稀释比例需准确，避光操作，避免荧光淬灭，影响鉴定结果。
冻存时DMSO需缓慢加入，避免损伤细胞；复苏时快速解冻，减少细胞内冰晶形成，提高复苏率。
实验过程中及时观察细胞形态，若出现污染（培养基浑浊、细胞形态异常），需立即丢弃，避免交叉污染。
所有实验动物相关操作需符合动物伦理要求，实验后妥善处理动物尸体。
六、实验结果
1. 原代培养24h后，细胞开始贴壁，形态呈圆形或短梭形；培养3-5天后，细胞逐渐伸展，呈现典型的星形或纤维状，细胞密度逐渐增加；纯化后，细胞形态均一，无明显杂细胞。
2. GFAP免疫荧光鉴定显示，阳性细胞率≥90%，表明获得高纯度的犬脑星形胶质细胞（BA）原代细胞，可用于后续科研实验。
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