卡梅德生物技术快报 | 核酸适配体文库测序：核酸适配体文库测序的技术原理、实验流程与数据解析
一、提出核心技术问题
在核酸适配体筛选的全流程中，核酸适配体文库测序是最关键的终点环节，其质量直接决定了能否获得高亲和力、高特异性的候选适配体。然而，经典的Sanger测序法由于通量低、效率差，长期制约了优质适配体的发现效率。
2023年，贾海静等在《生物化学与生物物理进展》发表特邀综述，系统梳理了这一问题的技术根源以及解决方案。本文基于该综述并结合相关文献，从技术实现角度对其进行拆解。
二、分析问题：传统测序方案的技术缺陷
从SELEX的技术流程来看，测序位于最后一个环节：文库设计→靶标孵育→分离→PCR扩增→核酸适配体文库测序→候选筛选→亲和力评价。
传统技术方案存在以下根本性缺陷：
缺陷1：通量严重不足
典型的SELEX起始文库包含10¹⁴-10¹⁵个随机序列。经过多轮筛选后，富集文库中仍然可能存在成千上万种不同的序列。传统方案中，将PCR产物与载体连接、转化宿主细胞、挑取少量克隆子（通常20-100个）进行Sanger测序，只能覆盖文库的极小部分。
缺陷2：遗漏稀有序列
高亲和力的适配体未必是文库中丰度最高的序列。在传统的少样本测序策略中，那些稀有但实际结合能力更强的候选序列极容易被遗漏。
缺陷3：PCR偏向性积累
多轮筛选循环中，PCR扩增的偏向性会导致某些序列被选择性放大或丢失。NGS可以监控这种偏向性，而传统测序无法做到。
三、解决问题：高通量测序的引入与技术方案
综述明确指出：随着二代测序价格的下降，高通量SELEX的二代测序技术已是核酸适配体筛选进程研究和候选适配体筛选的常规技术步骤。
（1）技术框架
在SELEX流程中整合NGS，涉及的关键步骤包括：
- 文库制备：将单链DNA/RNA转化为双链DNA，添加测序接头
- 边合成边测序：以Illumina平台为代表的方案，同时对数百万条模板进行测序
- 数据分析：包括预处理、富集分析、序列聚类和结合位点搜索
（2）生物信息学分析策略
综述及相关研究总结了多款HT-SELEX数据分析工具：
- FASTAptamer：基于序列丰度分析的经典工具
- APTANI：侧重结构特征分析
- AptaTRACE：全序列聚类，高准确性
- FSBC (Fast String-Based Clustering)：通过搜索各种长度的过表达字符串来估计聚类，可处理超过1500万条序列，聚类准确性和计算速度表现优异
（3）小分子靶标的特殊考量
综述特别针对小分子靶标适配体筛选进行了深入评述。由于小分子结合位点少、结构类似物多，筛选难度更大。为此，研究了三类主要方法：
- 基于靶标固定：存在空间位阻问题，但操作简单，应用广泛
- Capture-SELEX（文库固定）：统计了36种靶标的数据，降低靶标浓度有利于提高亲和力
- GO-SELEX（均相筛选）：筛选轮数更少，获得的适配体亲和力多在nmol/L水平
四、解决方案的效果数据
汇总综述及相关研究的量化数据：
- 序列通量提升：从传统方法的20-100条 → NGS方法>10 000条
- 筛选轮数缩短：Capture-SELEX一般7-15轮，GO-SELEX可达5-8轮，部分快速筛选方法可在5轮内完成
- 亲和力水平：小分子靶标适配体的Kd值已达纳摩尔级（10⁻⁹ mol/L），例如噻虫嗪适配体Kd=123 nmol/L，黄曲霉毒素M1适配体Kd=109 nmol/L
- 特异性评价：多种表征技术（SPR、ITC、BLI、纳米金比色法）的组合应用，可实现多角度验证
结语
NGS技术与SELEX的结合，使核酸适配体文库测序从"抽样式"升级为"全谱式"，这一基础性技术变革正在推动适配体筛选的效率大幅提升。然而，缺乏标准化的筛选程序、缺乏统一的大数据分析法则，仍是未来的突破方向。
参考文献：
[1] 贾海静, 高亚菁, 娄新徽. 核酸适配体筛选与亲和力评价技术主要研究方向、进展与挑战[J]. 生物化学与生物物理进展, 2023, 50(09): 2051-2076.
[2] Aoki T. Fast string-based clustering (FSBC) for high-throughput SELEX data[J]. Methods, 2019.
[3] 王钰. 甲氧苄啶适配体的筛选与应用鉴定[D]. 南京农业大学, 2023.