基于TR-FRET技术的BRD4靶向PROTAC降解剂在颞下颌关节骨关节炎中的研究

一、颞下颌关节骨关节炎的病理特征与研究背景

颞下颌关节骨关节炎的实质是退行性关节病变，过大的机械应力是造成该疾病的重要病因。软骨变薄、软骨下骨吸收和细胞外基质损伤是过度机械应力诱发的主要病理改变。近年来，炎症在颞下颌关节骨关节炎中的作用受到关注。溴结构域蛋白4作为表观遗传的阅读器，能特异性识别并结合组蛋白上乙酰化赖氨酸，从而调控基因转录过程。BRD4被认为是许多炎症性疾病的潜在治疗靶点，同时还能调控破骨细胞分化，参与骨质疏松。基于此，研究者假设抑制BRD4可以缓解由过度机械应力引起的颞下颌关节骨关节炎样病理变化。

二、BRD4抑制剂的体内保护作用

为探讨抑制BRD4在过大的机械应力下是否对软骨有保护作用，实验设置对照组、JQ1组、机械力组和机械力加JQ1注射组。超负荷14天后，软骨厚度较对照组减少60%，软骨下骨明显破坏，扩张血管附近有明显的炎症细胞浸润。而BRD4抑制剂JQ1可以缓解机械应力过大引起的软骨变薄，增加软骨细胞数量。通过观察骨体积比例、骨小梁数量、骨小梁厚度和骨小梁间隔等骨微结构参数，发现JQ1能抑制髁突软骨下骨吸收，有利于在过大的机械应力下维持软骨下骨的正常形态结构。TR-FRET BRD4/CRBN PROTAC试剂盒可用于定量检测PROTAC分子与BRD4和CRBN的双重结合活性，为降解剂筛选提供技术工具。

三、BRD4抑制对炎症因子表达的调控

为确认抑制BRD4是否能抑制机械应力诱导的软骨炎症，通过qRT-PCR和免疫组织化学检测了体内炎症因子的表达。超负荷14天后，Tnf-α、Il-1β和Il-6的mRNA水平明显增加，而JQ1可以降低这些炎症因子的表达。免疫组织化学染色结果与qRT-PCR结果一致，表明BRD4抑制剂JQ1可以抑制机械应力诱导的大鼠髁突软骨中炎症因子的表达。以IL-1β为刺激物的体外实验发现，JQ1和siBRD4均可抑制IL-1β诱导的Brd4、Il-6、Tnf-α和内源性Il-1β mRNA的增加。这些结果表明，抑制BRD4可缓解体内机械应力过大和体外IL-1β诱导的炎症因子表达。

四、BRD4调控TREM1介导的炎症反应的表观遗传机制

由于BRD4可以识别H3K27ac位点来调节基因转录，研究使用来自对照组和机械力组的软骨样本对H3K27ac抗体进行了ChIP-seq，以鉴定超负荷机械应力后软骨细胞中重叠增加的BRD4结合位点和H3K27ac结合位点。在超负荷机械应力后，共鉴定出522个基因H3K27ac结合增加，346个基因启动子区域BRD4结合增加。其中17个基因与BRD4或H3K27ac结合增加重叠，包括与骨关节疾病相关的Cystatin A、Mir-181d、Mir-181c和Trem1。基因轨迹表明，超负荷机械应力可以增加BRD4和H3K27ac在Trem1启动子区域的共同结合。TR-FRET BRD4/CRBN PROTAC试剂盒可用于评估降解剂与BRD4和CRBN的双重结合活性，验证其作用机制。

五、TREM1在BRD4介导的炎症反应中的关键作用

研究发现，BRD4抑制剂JQ1和siBRD4均能降低体内机械力或体外IL-1β诱导的Trem1 mRNA表达。为研究TREM1是否可调节其他炎症因子，构建了siTREM1，发现体外IL-1β诱导的内源性Il-1β、Il-6和Tnf-α mRNA的增加被siTREM1降低。结合先前发现，可得出结论：抑制BRD4可以在机械应力或IL-1β处理下调节TREM1介导的炎症反应。在细胞水平上，BRD4与炎症相关基因和microRNA的启动子区域的结合在机械应力刺激下增加，增强了Trem1和炎症因子如Il-1β、Tnf-α和Il-6的转录。IL-1β诱导的炎症是TREM1依赖性的，IL-1β和TREM1均受BRD4调节。

六、TR-FRET技术在BRD4降解剂研发中的应用

TR-FRET技术结合了时间分辨荧光和荧光共振能量转移两种检测原理。时间分辨荧光利用镧系元素螯合物的长寿命荧光特性，有效消除短寿命的背景荧光干扰。荧光共振能量转移发生在供体与受体荧光分子距离足够近时，通过非辐射能量转移产生特异性信号。在BRD4/CRBN PROTAC试剂盒中，将供体荧光分子标记的BRD4蛋白与受体荧光分子标记的CRBN蛋白共同孵育，当PROTAC分子同时结合两者时，供体与受体距离拉近，发生能量转移。该检测方法具有均相、免洗、高灵敏度和高通量的特点，适用于大规模化合物筛选。