单细胞转录组揭秘结直肠癌肝转移免疫耐药的核心机制
结直肠癌是全球范围内发病率第三、死亡率第二的恶性肿瘤，肝脏是结直肠癌最常见的致命转移部位，约30%~40%的结直肠癌患者最终会发生肝转移。随着免疫治疗普及，虽然为很多晚期肿瘤患者带来了生存希望，但结直肠癌肝转移（CRLM）对PD-1免疫治疗普遍耐药，疗效大打折扣，一直是临床研究亟待解决的痛点。为什么肝转移灶如此"顽固"，是什么机制帮助肿瘤抵抗免疫、驱动扩散？最新研究借助单细胞转录组、空间转录组等技术找到了明确答案。
结直肠癌肝转移免疫耐药的研究困境
过去受技术限制，传统批量测序只能检测整块组织的平均基因表达，会掩盖肿瘤微环境中不同细胞亚群的异质性信息，难以找到驱动转移和耐药的关键核心机制。而单细胞转录组测序技术可以在单细胞分辨率下解析每个细胞的独特基因表达谱，能够精准区分不同细胞类群的特征，为破解肿瘤微环境的调控机制提供了高分辨率的技术支撑。
单细胞转录组助力解析核心致癌机制
近日，北京大学肿瘤医院团队在《Cancer Research》（IF=13.3）发表研究成果，整合空间转录组、单细胞转录组测序、类器官模型、人源化动物模型等多组学技术，首次完整揭示了SPP1-CAF-CXCL12轴是结直肠癌肝转移发生与免疫治疗耐药的核心元凶。
完整调控通路
该研究明确了环环相扣的致病机制：
- 结直肠肿瘤细胞高分泌SPP1蛋白
- SPP1结合肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）表面的CD44受体
- 激活CAFs内的βcatenin/HIF1α通路，βcatenin稳定HIF1α蛋白并促进其核转位
- HIF1α直接结合CXCL12的启动子区域，上调CXCL12的转录与分泌
- 形成恶性正反馈：CXCL12进一步促进结直肠癌细胞上皮间质转化（EMT）与转移能力，同时上调SPP1表达，加速肿瘤进展
- 诱导免疫抑制：CXCL12抑制CD8+T细胞的肿瘤浸润与细胞毒性，最终导致免疫治疗耐药
研究核心亮点
- 全新机制：首次完整解析SPP1/βcatenin/HIF1α/CXCL12轴驱动结直肠癌肝转移与免疫逃逸的完整通路，填补了领域空白
- 新治疗靶点：证实SPP1与CXCL12是潜在双靶点，联合免疫检查点抑制剂具有明确治疗潜力
- 临床转化便捷：血浆SPP1可无创预测结直肠癌肝转移患者的免疫治疗疗效，容易落地临床应用
研究过程中，团队通过对MC38异种移植瘤进行单细胞转录组测序，验证了SPP1对肿瘤微环境的影响：SPP1过表达后，肿瘤微环境中CAFs数量显著增加，T细胞数量明显减少，直接印证了SPP1通过调控CAFs重塑免疫抑制微环境的结论。上述《Cancer Research》研究，背后离不开庞大且精细的实验数据支撑。和元具有成熟完善的高通量单细胞转录组测序服务平台，可提供从上游样本处理到下游深度生信分析的一站式解决方案。
单细胞转录组测序常见问题解答
基于和元丰富的项目经验，我们整理了科研人员最关心的几个核心问题：
Q：单细胞转录组测序需要生物学重复吗？
A：需要，不同样本间存在天然生物学差异，需要生物学重复消除偏差。目前一般要求人源样本每组至少5个重复，动物模型样本每组至少3个重复。
Q：3'转录组和5'转录组有什么区别？
- A：3'转录组通过poly(dT)捕获转录本3'端polyA，适合常规基因表达分析；5'转录组通过TSO序列捕获，适合需要捕获VDJ可变区的免疫组库分析。
Q：单细胞转录组和单细胞核转录组如何选择？
A：细胞转录组测序涉及两种样本制备方式，即单细胞悬液和单细胞核悬液制备。样本制备方式不同最终获得的单细胞图谱的细胞类型及细胞群比例也会有差异，两种方法各有优缺点及适用范围。主要以单细胞悬液为主，下述情况可以考虑单细胞核悬液：
（1）从关注细胞类型考虑：当关注的细胞类型较为脆弱，悬液制备过程中的机械压力可能造成损伤的情况下，如肝脏关注肝实质细胞，肾脏关注足细胞，脑组织关注神经元，心脏关注心肌细胞等，均推荐单细胞核悬液。
（2）从细胞直径考虑：对于心脏、肌肉、脂肪和巨核细胞等，因细胞直径大于30um或细胞性状不规则，细胞捕获环节容易堵塞芯片，选择单细胞核悬液。
（3）从处理方式考虑：冻存样本推荐单细胞核悬液。
（4）从组织特征考虑：由于组织中内源性酶丰富，悬液制备结果不理想，如胰腺等，推荐单细胞核悬液。
（5）耐药相关研究：因取样后无法立即确定样本是否入组，需要观察病人耐药情况再确定的情况，推荐单细胞核悬液。
（6）应激反应基因或温度胁迫相关研究：脑、神经组织或者温度胁迫相关研究中，单细胞悬液导致应激或温度相关基因表达改变较大，可能不能反应基因表达的真实情况，推荐单细胞核悬液。
因单细胞核悬液目前无权威的质控条件，因此除上述情况外，一般情况都推荐单细胞悬液制备。
Q：高通量单细胞转录组对样本有什么要求？
A：细胞活率：要求建议达到85%以上，活率低于70%的样本不建议继续实验。捕获过程对活细胞、死细胞、碎片和颗粒等没有选择性，都会被随机包裹，影响最终的结果，如细胞数不准确、UMI分布曲线上有效细胞与非细胞界线不明显、线粒体基因过多等。
总细胞量：要求提供5万-50万以上的高质量细胞，保证最终能捕获到6000-10000个满足分析需求的细胞；
结团率：要求小于20%，结团率大于40%的样本不建议继续实验。结团率高导致结在一起的两个或多个细胞被包裹在一个液滴中，被系统认为是一个细胞。结团率太高最终影响分析结果的准确性、或过大的结团可能会造成堵孔。
有核率：要求大于70%，有核率小于50%的样本不建议继续实验。捕获过程对活细胞、死细胞、碎片、颗粒和红细胞等没有选择性，都会被随机包裹，可能引起有效细胞识别不准确、有效细胞-非细胞界限模糊、背景升高等不利现象，有核率评估一定程度上可以预判这些问题。
细胞直径：要求不超过35μm，避免堵孔。
综上，单细胞转录组技术为肿瘤微环境研究、耐药机制解析提供了高分辨率的核心工具，本次研究揭示的结直肠癌肝转移核心调控轴，为后续临床治疗和新药开发提供了明确方向，也为同类肿瘤研究提供了可靠参考。