抗IL-3R-α阻断抗体处理的肿瘤来源内皮细胞外泌体（EVs）的抗血管生成效应：对Wnt/β-catenin通路的洞察
引言
血管生成，即从已有血管中形成新血管的过程，是肿瘤生长和转移的关键过程。肿瘤微环境中的促血管生成因子在促进这一过程中起着关键作用。在这些因子中，具有促血管生成特性的细胞因子白细胞介素-3（IL-3）由乳腺癌和卵巢癌微环境中的炎症细胞释放。除了其旁分泌效应外，IL-3还在人乳腺癌和肾肿瘤中作为TECs的自分泌因子，进一步驱动血管生成。
细胞外囊泡（EVs）是由细胞分泌的小型膜结合囊泡，可将包括蛋白质、脂质和核酸在内的生物活性分子传递给受体细胞，从而介导细胞间通讯。我们之前的研究表明，IL-3处理的内皮细胞（ECs）释放的EVs可作为对邻近ECs的旁分泌机制，促进血管生成。在本研究中，我们旨在探讨抗IL-3R-α阻断抗体对TECs释放的EVs（抗IL-3R-EVs）促血管生成特性的影响。
方法
2.1 细胞培养与EVs分离
从人乳腺癌和肾肿瘤组织中分离TECs，并在体外培养。使用超速离心法从经或未经抗IL-3R-α阻断抗体处理的TECs的条件培养基中分离EVs。
2.2 miRNA分析
使用miRNA微阵列和定量实时PCR（qRT-PCR）分析原生TECs来源的EVs（EVs）和抗IL-3R-EVs的miRNA含量。使用生物信息学工具鉴定差异表达的miRNA，并预测其潜在靶标。
2.3 体外和体内血管生成测定
使用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的管形成测定在体外评估EVs和抗IL-3R-EVs的促血管生成效应。在体内，在裸鼠中进行Matrigel栓塞测定以评估新生血管的形成。
2.4 蛋白质印迹和免疫荧光
使用蛋白质印迹和免疫荧光染色分析经不同EVs处理的TECs中Wnt/β-catenin通路相关蛋白（包括β-catenin、APC、GSK3β和c-myc）的表达水平。
结果
3.1 抗IL-3R-EVs在体外和体内抑制血管生成
在体外，管形成测定表明，与原生EVs相比，抗IL-3R-EVs显著降低了HUVECs形成管状结构的能力。在体内，Matrigel栓塞测定表明，抗IL-3R-EVs处理可防止新生血管的形成，更重要的是，可诱导TECs来源的新生血管退化。
3.2 靶向Wnt/β-catenin通路的miRNA的差异调控
比较EVs和抗IL-3R-EVs的miRNA含量时，发现靶向Wnt/β-catenin通路的两种miRNA的差异调控。直接靶向β-catenin的miR-214-3p在抗IL-3R-EVs中上调，而靶向APC和GSK3β的miR-24-3p下调。
3.3 miRNA调控对Wnt/β-catenin通路的影响
当转移到TECs中时，抗IL-3R-EVs、pre-miR-214-3p-EVs和antago-miR-24-3p-EVs导致低水平的β-catenin和高水平的“β-catenin降解复合体”的两个成员APC和GSK3β。此外，在经这些EVs处理的TECs中，发现Wnt/β-catenin通路的下游靶标c-myc下调，这与miR-214-3p和miR-24-3p的网络分析预测的基因靶向一致。
3.4 体内验证miRNA对血管生成的影响
在裸鼠中的体内研究表明，用pre-miR-214-3p-EVs和antago-miR-24-3p-EVs处理可损害血管生长，如Matrigel栓塞中血红蛋白含量减少所示。当采用pre-miR-214-3p-EVs和antago-miR-24-3p-EVs的联合治疗时，这些效应更为显著。
讨论
本研究的结果为TECs来源的EVs促血管生成效应的机制以及靶向IL-3R-α/Wnt/β-catenin通路的潜在治疗益处提供了新的见解。我们已经表明，抗IL-3R-α阻断抗体可以改变TECs来源的EVs的miRNA货物，从而在体内和体外抑制血管生成。
抗IL-3R-EVs中miR-214-3p和miR-24-3p的差异调控表明这些miRNA与Wnt/β-catenin通路之间存在复杂的相互作用。miR-214-3p通过直接靶向β-catenin降低这一关键蛋白的水平，从而抑制Wnt/β-catenin通路的激活。另一方面，靶向APC和GSK3β的miR-24-3p下调导致这些Wnt/β-catenin通路负调控因子的水平增加，进一步抑制其活性。
在经抗IL-3R-EVs、pre-miR-214-3p-EVs和antago-miR-24-3p-EVs处理的TECs中，Wnt/β-catenin通路的下游靶标c-myc下调，为该通路参与TECs来源的EVs促血管生成效应提供了额外证据。c-myc是一种众所周知的癌基因，可促进细胞增殖和血管生成，其抑制可有助于本研究中观察到的抗血管生成效应。
体内对miRNA血管生成效应的验证进一步支持了靶向IL-3R-α/Wnt/β-catenin通路的治疗潜力。用pre-miR-214-3p-EVs和antago-miR-24-3p-EVs处理的动物血管生长受损，尤其是当联合使用时，突出了这些miRNA在抑制血管生成中的协同效应。
此外，我们的研究表明，通过改变TECs-EVs-miRNA货物，IL-3R阻断在抑制原生TECs来源的EVs促血管生成效应方面可能比miRNA靶向具有显著优势。IL-3R阻断可同时影响Wnt/β-catenin通路内的多个靶标，从而更全面地抑制血管生成。
结论
总之，本研究确定了经典Wnt/β-catenin通路是TECs来源的EVs促血管生成效应的相关机制。抗IL-3R-EVs中miR-214-3p和miR-24-3p的差异调控为IL-3R阻断抗血管生成效应的分子基础提供了新的见解。此处提供的证据表明，通过改变TECs-EVs-miRNA货物，IL-3R阻断可能是一种有前景的抑制肿瘤血管生成的治疗策略。需要进一步研究以探索这种方法的全部潜力，并开发用于癌症治疗的新型抗血管生成疗法。