转录组分析（四）：文献分析思路

文献名称：Transcriptome analysis of an apple (Malus × domestica) yellow fruit somatic mutation identifies a gene network module highly associated with anthocyanin and epigenetic regulation.

研究内容：用转录组研究苹果果皮颜色机制

已有研究：果皮颜色与花青素合成和积累相关，涉及的关键基因已研究清楚。问题转变为花青素合成运输存储调控与哪些基因相关。

可能研究的问题：①找到与花青素相关的未研究的其他基因；②已研究的基因究竟发生了什么变化导致果皮变色

项目设计

（1）分组：KID红色、BLO黄色

（2）取样：四个时期，S1：7.16，S2：8.7，S3：8.26，S4：9.14。3个生物学重复，共24个样本

（3）建库：NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit试剂盒

（4）测序：

• 模式：single-end
• 读长：101bp
• 测序仪：Hiseq2000

测序数据量

 花青素含量测定表格

 

1. 特异表达分析

根据共有特有基因分析，得出哪两个样本间差异大/小

fig.S4 共有和特有表达基因

• Genes of RPKM>1.0 were defined to be expressed，大于1认为基因在样本中表达;
• 32019条基因在至少一个样本中表达；
• S1-S4，表达的基因数目减少；

 

 

fig.2 差异表达基因

• 对应时期之间共鉴定到143条（去除重复126条），其中15条在2个时期都有差异，1条在3个时期有差异;
• 相邻时期的差异表达分析

2. WGCNA分析

 Fig. 3. Weighted gene co-expression network analysis (WGCNA) of differentially expressed genes (DEGs) identified from the two ‘Gala’ strains over four developmental stages. 

• 使用3299条差异表达基因进行WGCNA分析；
• 模块Pink与花青素相关性很高；
• 模块Pink包含34条基因；
• WD40、DFR与其他基因连接较少。

Table1. 粉色模块基因列表

锁定关键基因

• 使用 mapman 进行功能注释，将基因分成3组；
• 其中只有group3包含24条基因，与花青素相关，其中12条在之前报道过；
• MdMYB10和MdGST与花青素的GS最高【在PPI中与其他基因连接最多】；
• qPCR 验证了 RNA-Seq定量的可靠性

3. 实验验证

Fig. 5. Comparison of expression profiles of ten representative genes from module ‘Pink’ as measured by RNA-seq and qRT-PCR.

关键基因如何变化？MdMYB10和MdGST

• MdMYB10：23倍差异；
• MdGST：46倍差异；
• qPCR结果与RNA-Seq结果一致

4. 功能验证

（1）红苹果基因敲减→黄苹果

（2）黄苹果基因过表达→红苹果

5. 机制研究

是什么导致了表达的差异？

1. DNA变异？

• PCR扩增两种苹果基因，未发现序列变异

2. 表观修饰？

• MdGST未发现甲基化水平差异
• MdMYB10的MR3和MR7区域存在差异甲基化，x碱基y甲基化水平

3. 转录调控？

• 生信预测，MdGST上游有19个MYB-，11个MYC-TF 结合位点，有可能是转录因子调控
• MYB10甲基化低表达→与GST的转录因子结合减少→GST表达减少→花青素减少→果皮变黄