【干货指南】IGV使用攻略：ChIP-seq、ATAC-seq结果怎么看？一篇带你入门基因组可视化
做完ChIP-seq、CUT&Tag、ATAC-seq、DAP-seq、RNA-seq等之后，在拿到的数据分析报告里有峰图、有热图、有注释表，也有差异基因列表，那么如果想看看关注的那个基因附近到底有没有信号，处理组和对照组的峰肉眼看起来差别大不大，这个peak是不是刚好落在启动子、增强子或候选结合区域，想做ChIP-qPCR验证应该怎么挑位点等等。这时候一个非常实用的工具就派上用场了，IGV（Integrative Genomics Viewer）是一款常用的基因组数据可视化工具，可用于查看参考基因组、基因注释、测序比对结果、信号轨道、peak区域、突变位点等多种数据。简单来说，它可以把表格里的结果放回到基因组坐标上，让我们直观看到某个基因、某段区域、某个peak到底长什么样。
一、下载与安装
在正式使用IGV之前，第一步是下载安装软件。IGV目前有多种使用形式，包括桌面版IGV Desktop、网页版IGV-Web，以及可嵌入网页的igv.js。对于大多数科研用户来说，日常查看BAM、bigWig、BED、GTF/GFF等文件，优先推荐使用IGV Desktop桌面版。IGV官方说明中也明确，IGV Desktop是一款用于基因组数据可视化探索的Java桌面应用，支持加载本地文件和云端数据。
打开IGV官方网站（https://igv.org/），进入Download页面，根据自己电脑系统选择对应版本即可，注意优先下载带Java的版本。IGV 基于Java运行，带Java的安装包自带了运行环境，下载后解压（或安装）即可直接用，不必再单独折腾JDK，对新手最友好。如果选了不带Java的版本，则需要本机预装Java。
二、界面速览
第一次打开 IGV，界面从上到下大致是这样几块：
顶部工具栏：最左边是参考基因组下拉框；中间是定位/搜索框（输入基因名或坐标的地方）；右边是导航按钮和缩放滑条。
染色体示意图：显示当前在哪条染色体的哪个位置。
标尺：显示坐标范围。
数据轨道区：所有加载进来的数据都在这里，一行就是一条轨道。
底部固定轨道：参考序列轨道、RefSeq基因注释轨道。
——记住一个万能操作：几乎所有显示选项，都藏在轨道上右键出来的菜单里。不知道怎么调的时候，先右键。
三、IGV基础操作：从打开文件到定位基因
Step 1：选择或导入参考基因组
在IGV中查看任何数据之前，首先要加载参考基因组。参考基因组相当于IGV显示所有数据的坐标系统，后续加载的文件都会按照这个坐标系统进行展示。需要确认使用的参考基因组版本是否与项目分析时一致，这一点非常重要。同一个物种不同版本的参考基因组，基因坐标可能并不完全一致。如果参考基因组版本选错，后续看到的peak位置、基因位置就可能发生偏移，甚至完全对不上。
（1）常见物种：直接选择IGV内置参考基因组
点击顶部菜单栏：Genomes → Download Hosted Genomes...（旧版本为 Load Genome From Server），在弹出的窗口中搜索或选择目标物种和基因组版本。
（2）UCSC收录物种：通过GenArk加载参考基因组
如果目标物种不是IGV常用内置列表中的物种，也可以尝试通过UCSC GenArk加载。
（3）非模式物种：加载自定义FASTA参考基因组
对于很多植物项目、非模式物种项目、自组装基因组项目，IGV中通常没有现成的参考基因组。这时就需要手动加载自定义参考基因组。通常需要准备两个文件，参考基因组序列文件（.fa 或 .fasta）和参考基因组索引文件（.fai）。例如：sample_genome.fa，sample_genome.fa.fai。FAI文件的作用是帮助IGV快速定位某条染色体或某段基因组区域，如果没有FAI文件，可以用samtools生成。
加载参考基因组后，如果想在IGV中看到基因位置、外显子、内含子、转录方向等信息，还需要加载注释文件。
常见注释文件格式包括GFF/GFF3/GTF等。
Step 2：加载数据文件
通过 File → Load from File...（本地文件）或 Load from URL...（在线/云端文件）导入数据。IGV 支持的格式很全，常见的包括：
对于BAM文件建议要排序、要建索引。sorted.bam生成sorted.bam.bai，索引文件（.bai / .crai）和BAM放在同一个目录下。
Step 3：定位目标基因或目标区域
IGV中常用的定位方式有两种。
（1）直接输入基因组坐标。
缩放：用右上角滑条，或双击放大、按住拖动平移。
要素跳转：选中一条注释轨道后，用快捷键在相邻的基因/外显子之间快速前进、后退，找目标基因非常高效。
感兴趣区域：把常看的区域标记为Region of Interest，方便反复回访和批量截图。
（2）输入基因名。
如果注释文件支持，IGV可以根据基因名跳转到对应区域。但对于一些非模式物种，基因ID格式可能不统一，建议优先使用报告中的基因组坐标进行定位。
四、不同组学数据在IGV里怎么看？
1、ChIP-seq / CUT&Tag：看蛋白或组蛋白修饰是否富集
ChIP-seq和CUT&Tag常用于研究转录因子结合、组蛋白修饰分布等。在IGV中查看时，可以重点关注目标区域是否存在明显信号峰，处理组和对照组之间是否存在差异，IgG或Input背景是否较低，peak是否落在启动子、增强子或基因体区域，多个生物学重复信号趋势是否一致等等。如果是转录因子ChIP-seq，通常更关注候选靶基因启动子或增强子附近是否存在结合峰。如果是组蛋白修饰，例如H3K4me3、H3K27ac、H3K27me3等，则需要结合不同修饰的生物学意义进行判断，例如H3K4me3常与启动子活跃状态相关，H3K27ac常与活跃启动子或增强子相关，H3K27me3常与转录抑制相关。
2、ATAC-seq：看染色质开放区域
ATAC-seq主要用于检测染色质开放性。在IGV中，ATAC-seq信号通常表现为某些区域的reads富集或开放峰。查看时可关注开放峰是否位于启动子区域，是否位于基因间区潜在增强子区域，处理组和对照组开放程度是否不同，
候选转录因子motif是否落在开放区域内，开放区域是否与差异表达基因关联等等。例如某个差异表达基因在处理后表达上调，同时其启动子附近ATAC-seq信号增强，那么这提示该基因可能受到染色质开放状态变化的影响。如果进一步结合motif分析，发现该开放区域中存在某个候选转录因子的motif，就可以继续设计后续实验，如ChIP-qPCR、DAP-seq、EMSA、双荧光素酶报告实验等，验证调控关系。
3、RNA-seq：看基因表达覆盖和转录本结构
RNA-seq结果中IGV常用于查看目标基因reads覆盖情况，不同样本之间表达量差异，外显子覆盖是否均匀，是否存在可疑剪接事件，候选融合、突变或局部异常表达区域等等。需要注意的是，RNA-seq的IGV展示和ChIP-seq、ATAC-seq不同。RNA-seq更关注外显子覆盖、剪接连接和转录本结构，而不是peak富集。如果是查看表达量差异，建议使用标准化后的bigWig文件进行展示；如果是查看剪接或局部reads细节，可以加载BAM文件进一步放大查看。
五、操作注意
1、信号轨道最好统一Y轴：
如果两个样本的Y轴范围不同，看起来峰高并不能直接比较。在比较处理组和对照组时，建议统一设置轨道高度和数据范围，使用Group Autoscale等方式辅助比较。否则有些轨道会因为自动缩放而显得信号很高，但实际差异并不明显。
2、不要只看单个样本：
如果项目有生物学重复，建议同时查看多个重复样本。一个可靠的候选区域，最好在同组重复之间具有相对一致的信号趋势。
3、注意Input、IgG或背景信号：
对于ChIP-seq、CUT&Tag等富集类实验，目标样本有信号不代表一定可靠，还需要看对照背景。如果Input或IgG背景也很高，则需要谨慎解释。
4、注意基因方向：
启动子区域不是简单地等于基因左边。对于正链基因，启动子通常在基因坐标上游；对于负链基因，启动子方向相反。因此，在IGV中查看peak是否位于启动子区域时，一定要结合基因转录方向判断。
六、如何用IGV辅助ChIP-qPCR验证位点选择？
很多课题做完ChIP-seq、CUT&Tag、DAP-seq或ATAC-seq后，下一步会考虑做ChIP-qPCR、qPCR、EMSA或双荧光素酶等验证实验。在这些实验设计之前，IGV可以帮助筛选更合适的候选位点。一般来说，适合优先考虑的位点具有以下特点：
以ChIP-qPCR为例，设计验证位点时通常不建议只看peak列表，而是要结合IGV截图综合判断。因为peak表格只能告诉我们这个区域被识别为peak，但IGV能进一步告诉我们这个peak的形态、背景、相邻区域信号以及与基因结构的关系。如果一个peak虽然统计上显著，但在IGV中呈现背景高、信号分散、重复不一致等情况，则后续验证时可能风险较高。